中华人民共和国农业农村部公告 第186号

　　根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定，经审查，批准郑州百瑞动物药业有限公司等17家单位申报的双氯芬酸钠注射液等5种兽药产品为新兽药，核发《新兽药注册证书》，发布产品质量标准、说明书和标签，并发布双氯芬酸每日允许摄入量（ADI）和最高残留限量（MRLs）（试行）、双氯芬酸残留检测方法标准（试行）、磺胺氯吡嗪残留检测方法标准（试行），自发布之日起执行。

　　 批准华北制药集团动物保健品有限责任公司等9家单位申报的加米霉素等2种兽药产品变更注册，自发布之日起执行。

　　 特此公告。

　　 附件：1. 新兽药注册目录

　　　　2.质量标准

　　　　3. 说明书和标签

　　　　4.双氯芬酸每日允许摄入量（ADI）和最高残留限量（MRLs）（试行）

　　　　5.双氯芬酸残留检测方法标准（试行）

　　　　6.磺胺氯吡嗪残留检测方法标准（试行）

　　　　

　　　　　　农业农村部

　　　　2019年6月26日

　

　　附件1

　　新兽药注册目录

　　 

　　

　　

　　附件3

　　　双氯芬酸钠注射液等5种兽药产品说明书和标签

　　一、双氯芬酸钠注射液说明书和标签

　　（一）双氯芬酸钠注射液说明书兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：双氯芬酸钠注射液

　　商品名称：

　　英文名称：Diclofenac Sodium Injection

　　汉语拼音：Shuanglüfensuanna Zhusheye

　　【主要成分】 双氯芬酸钠

　　【性状】 本品为几乎无色的澄明液体。

　　【药理作用】 非甾体类解热镇痛抗炎药。双氯芬酸钠是一种衍生于苯乙酸类的非甾体消炎镇痛药，其作用机理为抑制环氧化酶活性，从而阻断花生四烯酸向前列腺素的转化。同时，它也能促进花生四烯酸与甘油三脂结合，降低细胞内游离的花生四烯酸浓度，而间接抑制白三烯的合成。

　　【适应证】 辅助治疗奶牛临床型乳房炎引起的发热。。

　　【用法与用量】 肌内注射：每1kg体重，奶牛2.2mg，每日1次，连用3日。

　　【不良反应】 按规定的用法用量使用尚未见不良反应。

　　【注意事项】 1.禁用于肝功能、肾功能损伤的动物。

　　2.禁用于胃溃疡的动物。

　　【休药期】 牛19日；弃奶期144小时。

　　【规格】 按C14H10Cl2NNaO2计算（1）10ml∶0.5 g（2）100 ml∶5 g

　　【包装】

　　【贮藏】 避光，密闭保存。

　　【有效期】 24个月。

　　【批准文号】

　　【生产企业】

　　（二）双氯芬酸钠注射液标签兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：双氯芬酸钠注射液

　　商品名称：

　　英文名称：Diclofenac Sodium Injection

　　汉语拼音：Shuanglüfensuanna Zhusheye

　　【主要成分】 双氯芬酸钠

　　【性状】 本品为几乎无色的澄明液体。

　　【适应证】 非甾体类解热镇痛抗炎药。辅助治疗奶牛临床型乳房炎引起的发热。

　　【用法与用量】 肌内注射：每1kg体重，奶牛2.2mg，每日1次，连用3日。

　　【规格】 按C14H10Cl2NNaO2计算（1）10ml∶0.5 g（2）100 ml∶5 g

　　【批准文号】

　　【生产日期】

　　【生产批号】

　　【有效期】至

　　【休药期】 牛19日；弃奶期144小时。

　　【贮藏】 避光，密闭保存。

　　【包装】

　　【生产企业】

　　二、磺胺氯吡嗪钠甲氧苄啶可溶性粉说明书和标签

　　（一）磺胺氯吡嗪钠甲氧苄啶可溶性粉说明书兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：磺胺氯吡嗪钠甲氧苄啶可溶性粉

　　商品名称

　　英文名称：Sulfachloropyrazine Sodium and Trimethoprim Soluble Powder

　　汉语拼音：Huang'an Lübiqinna Jiayangbianding Kerongxingfen

　　【主要成分】 磺胺氯吡嗪钠、甲氧苄啶。

　　【性状】 本品为淡黄色粉末。

　　【药理作用】 药理学 磺胺氯吡嗪钠抗球虫的作用机理主要是竞争二氢叶酸合成酶，抑制二氢叶酸的合成，从而起到阻碍球虫生长的作用。其作用峰期是第二代裂殖体，对第一代裂殖体也有一定作用。甲氧苄啶抗球虫作用机理为抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸不能还原成四氢叶酸，妨碍球虫核酸合成，进而抑制球虫生长繁殖。甲氧苄啶与磺胺氯吡嗪钠合用时，可以从两个不同环节同时阻断球虫叶酸代谢而起协同作用。

　　药动学 本品内服后，磺胺氯吡嗪和甲氧苄啶经胃肠道吸收迅速且良好，分布广泛。磺胺氯吡嗪的达峰时间为3 ~ 4小时，半衰期为7.6小时，消除较缓慢；甲氧苄啶的达峰时间为1 ~ 2小时，半衰期为2.7小时，消除较快。

　　【适应症】 用于治疗鸡球虫病。

　　【用法与用量】 以本品计。混饮：每1L水，鸡1 ~ 1.5g，连用3 ~ 5日。

　　【不良反应】 按规定的用法用量使用未见不良反应。

　　【注意事项】1.蛋鸡产蛋期禁用。

　　2.按推荐剂量连续给药不超过5日。

　　3.不得在饲料中添加长期使用。

　　【休药期】 鸡9日。

　　【规格】 100g∶磺胺氯吡嗪钠20g+甲氧苄啶4g

　　【包装】

　　【贮藏】 遮光，密封保存。

　　【有效期】 24个月。

　　【批准文号】

　　【生产企业】

　　地址：河南省郑州市新郑航空港区空港五路

　　（二）磺胺氯吡嗪钠甲氧苄啶可溶性粉标签兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：磺胺氯吡嗪钠甲氧苄啶可溶性粉

　　商品名称

　　英文名称：Sulfachloropyrazine Sodium and Trimethoprim Soluble Powder

　　汉语拼音：Huang'an Lübiqinna Jiayangbianding Kerongxingfen

　　【主要成分】 磺胺氯吡嗪钠、甲氧苄啶

　　【性状】 本品为淡黄色粉末。

　　【适应症】 用于治疗鸡球虫病。

　　【用法与用量】 以本品计。混饮：每1L水，鸡1 ~ 1.5g，连用3 ~ 5日。

　　【规格】 100g∶磺胺氯吡嗪钠20g+甲氧苄啶4g

　　【批准文号】

　　【生产日期】

　　【生产批号】

　　【有效期】至

　　【休药期】 鸡9日，蛋鸡产蛋期禁用。

　　【贮藏】 遮光，密封保存。

　　【包装】

　　【生产企业】

　　地址：河南省郑州市新郑航空港区空港五路

　　三、双葛止泻口服液说明书和标签

　　（一）双葛止泻口服液说明书兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：双葛止泻口服液

　　商品名称：

　　汉语拼音：Shuangge Zhixie Koufuye

　　【主要成分】 金银花、葛根、黄芩、黄连、白芍等。

　　【性状】 本品为棕红色至棕褐色液体。

　　【功能与主治】 清热燥湿，解毒止泻。主治仔猪湿热泄泻，证见黄色糊状或稀粥样粪便、或挟有黏液，鼻盘微干等。

　　【用法与用量】 灌服：一次量，每1kg体重，仔猪0.34ml，一日2次，连用5日。

　　【不良反应】 暂未发现不良反应。

　　【注意事项】

　　【规格】 每1ml相当于原生药0.45g。

　　【包装】 250ml/瓶。

　　【贮藏】 密封，置阴凉处。

　　【有效期】 24个月。

　　【批准文号】

　　【生产企业】

　　（二）双葛止泻口服液标签

　　兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：双葛止泻口服液

　　商品名称：

　　汉语拼音：Shuangge Zhixie Koufuye

　　【主要成分】 金银花、葛根、黄芩、黄连、白芍等。

　　【性状】 本品为棕红色至棕褐色液体。

　　【功能与主治】 清热燥湿，解毒止泻。主治仔猪湿热泄泻，证见黄色糊状或稀粥样粪便、或挟有黏液，鼻盘微干等。

　　【用法与用量】 灌服：一次量，每1kg体重，仔猪0.34ml，一日2次，连用5日。

　　【规格】 每1ml相当于原生药0.45g。

　　【批准文号】

　　【生产日期】

　　【生产批号】

　　【有效期】至

　　【贮藏】 密封，置阴凉处。

　　【包装】 250ml/瓶。

　　【生产企业】

　　四、烯丙孕素标兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：烯丙孕素

　　英文名称：Altrenogest

　　汉语拼音：Xibingyunsu

　　【性状】本品为淡黄色至黄色结晶性粉末；无臭；几乎无引湿性。

　　【包装】

　　【生产批号】

　　【生产日期】

　　【有效期】 至

　　【贮藏】 遮光，密闭保存。

　　【批准文号】

　　【运输注意事项】 防潮防晒。

　　【生产企业】杭州裕美生物科技有限公司。

　　地址：浙江省桐庐县莪山乡山阴岭（桐钟路8号）

　　五、烯丙孕素内服溶液说明书和标签

　　（一）烯丙孕素内服溶液说明书兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：烯丙孕素内服溶液

　　英文名称：Altrenogest Oral Solution

　　汉语拼音：Xibingyunsu Neifurongye

　　【主要成分】 烯丙孕素

　　【性状】 本品为淡黄色至黄色澄清油状液体。

　　【药理作用】 药效学 性激素类药。烯丙孕素与天然黄体酮的作用类似。给药期间能够抑制脑垂体分泌促性腺激素，阻止卵泡发育及发情；给药结束后，脑垂体恢复分泌促性腺激素，促进卵泡发育与发情。停药时卵泡发育程度一致，加上促性腺激素的分泌同步恢复，促使所有动物在停药5～8日后同期发情。

　　药动学 本品在胃肠道迅速吸收，首次给药1小时后达到血药浓度的峰值，第18次给药约4小时后达到血药浓度峰值。烯丙孕素主要经肝脏代谢，通过胆汁排出，消除半衰期约14个小时。

　　【适应证】 用于控制后备母猪同期发情。

　　【用法与用量】 以烯丙孕素计。直接用5ml喷头饲喂或喷洒在饲料上内服，一次量，后备母猪20mg（5ml），连用18天。

　　【不良反应】 给药量不足可能导致卵泡囊肿。

　　【注意事项】 1.仅用于至少发情过一次的性成熟的母猪。

　　2.每头动物单独给药，确保每日给药剂量。

　　3.有急性、亚急性、慢性子宫内膜炎的母猪慎用。

　　4.操作时应穿戴防护服和手套，操作后和用餐前应洗手。

　　5.妊娠和育龄妇女应避免接触本品，如须操作应非常小心。意外接触可能导致月经紊乱或妊娠期延长，所以应尽量避免皮肤直接接触，如意外渗漏至皮肤，应立即用肥皂和水清洗。

　　【休药期】 猪9日。

　　【规格】 0.4%

　　【包装】

　　【贮藏】 遮光，密闭保存。

　　【有效期】 24个月；瓶子开启后30日内有效。

　　【批准文号】

　　【生产企业】上海同仁药业股份有限公司上海兽药厂

　　地址：上海市闵行区莘北路500号

　　（二）烯丙孕素内服溶液标签兽用

　　【兽药名称】

　　通用名称：烯丙孕素内服溶液

　　英文名称：Altrenogest Oral Solution

　　汉语拼音：Xibingyunsu Neifurongye

　　【主要成分】 烯丙孕素

　　【性状】 本品为淡黄色至黄色澄清油状液体。

　　【适应证】 用于控制后备母猪同期发情。

　　【用法与用量】 以烯丙孕素计。直接用5ml喷头饲喂或喷洒在饲料上内服，一次量，后备母猪20mg（5ml），连用18天。

　　【规格】 0.4%

　　【批准文号】

　　【生产日期】

　　【有效期】至

　　【休药期】猪9日

　　【包装】

　　【贮藏】 遮光，密闭保存；瓶子开启后30日内有效。

　　【生产企业】上海同仁药业股份有限公司上海兽药厂

　　地址：上海市闵行区莘北路500号 

　　附件4

　　双氯芬酸每日允许摄入量（ADI）

　　和最高残留限量（MRLs）（试行）

　　申报单位参照欧盟有关标准制定了双氯芬酸的每日允许摄入量（ADI）和双氯芬酸在牛组织及牛奶中的最高残留限量（MRL），如下表：　　

活性成分	残留标示物	动物品种	靶组织	MRLs
双氯芬酸ADI：0～0.5μg/kg b.w./d	双氯芬酸	牛	肌肉	5μg•kg-1
			脂肪	1μg•kg-1
			肝脏	5μg•kg-1
			肾脏	10μg•kg-1
			牛奶	0.1μg•kg-1

　　附件5

　　双氯芬酸残留检测方法标准（试行）

　　牛可食性组织及牛奶中双氯芬酸残留量的测定

　　液相色谱-串联质谱法

　　1 范围

　　本标准规定了牛可食性组织（肌肉、肝脏、肾脏和脂肪）及牛奶中，双氯芬酸残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。

　　本标准适用于牛的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶中双氯芬酸残留量的测定。

　　2 规范性引用文件

　　下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法

　　GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T 6379.1—2004，ISO 5725-1:1994，IDT）

　　GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T 6379.2—2004，ISO 5725-2: 1994，IDT）

　　农业部农牧发[2003]1号兽药残留试验技术规范（试行）

　　3 原理

　　将匀浆后的肌肉、肝脏和肾脏样品，以0.9%氯化钠溶液混悬后，样品中的双氯芬酸及双氯芬酸-13C（内标），用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯提取液浓缩至干，残渣以流动相复溶，液相色谱-串联质谱法检测，内标法定量。

　　将匀浆后的脂肪样品水浴加热融化后，样品中的双氯芬酸及双氯芬酸-13C（内标），用乙腈-乙酸乙酯溶液提取，上清液脱脂后，将乙腈提取液浓缩至干，残渣以流动相复溶，液相色谱-串联质谱法检测，内标法定量。

　　将牛奶均质后，样品中的双氯芬酸及双氯芬酸-13C（内标），用乙腈提取，提取时加入乙酸铵，上清液脱脂后，将乙腈提取液浓缩至干，残渣以流动相复溶，液相色谱-串联质谱法检测，内标法定量。

　　4 试剂和材料

　　除特殊注明外，所有试剂均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

　　4.1双氯芬酸钠对照品：CAS 15307-79-6，纯度≥98.0%。

　　4.2双氯芬酸钠-13C同位素内标对照品：CAS 1261393-73-0，纯度≥98.0%。

　　4.3乙腈：色谱纯。

　　4.4甲醇：色谱纯。

　　4.5甲酸：质谱级。

　　4.6乙酸乙酯。

　　4.7 乙腈。

　　4.8 正己烷。

　　4.9 氯化钠。

　　4.10乙酸铵。

　　4.11 0.9%氯化钠溶液：称取氯化钠0.9g于烧杯中，加适量水使完全溶解，完全转入100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，即得。

　　4.12 乙腈-乙酸乙酯溶液：将50mL的乙腈与20mL的乙酸乙酯混匀，即得。

　　4.13 0.1%甲酸乙腈溶液：量取1mL甲酸置于1000mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，混匀，即得。

　　4.14 0.1%甲酸溶液：量取1mL甲酸置于1000mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，混匀，即得。

　　4.15乙腈饱和过的正己烷：将50ml乙腈与150ml正己烷混合，涡旋30s，静置后取用上层液体。

　　4.16双氯芬酸标准储备溶液：准确称取双氯芬酸钠对照品10.75mg（准确至0.01mg，相当于双氯芬酸10.00mg）于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，配制成浓度为1mg/mL的双氯芬酸标准储备溶液。-20 ℃以下保存，有效期6个月。

　　4.17双氯芬酸标准中间储备溶液：准确移取双氯芬酸标准储备溶液1ml于10mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，混匀，配制成浓度为100μg/mL的双氯芬酸标准中间储备溶液。2～8 ℃保存，有效期3个月。

　　4.18双氯芬酸系列标准工作溶液：根据所需系列标准工作溶液的浓度，准确量取一定量的双氯芬酸标准中间储备溶液，置于10mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，混匀，配制成双氯芬酸系列标准工作溶液，用于建立肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶的基质匹配的标准曲线。2～8℃保存，有效期1个月。

　　4.19双氯芬酸-13C标准储备溶液：准确称取双氯芬酸钠-13C同位素内标对照品13.46mg（准确至0.01mg，相当于双氯芬酸-13C 10.00mg）于10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀，配制成浓度为1mg/mL的双氯芬酸-13C标准储备溶液。-20℃以下保存，有效期6个月。

　　4.20双氯芬酸-13C标准中间储备溶液：准确移取双氯芬酸-13C标准储备溶液1ml置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，混匀，配制成浓度为10μg/mL的双氯芬酸-13C标准中间储备溶液。2～8 ℃保存，有效期3个月。

　　4.21双氯芬酸-13C标准工作溶液：准确移取双氯芬酸-13C标准中间储备溶液0.5ml，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，配制成浓度为500ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液，作为肌肉、肝脏、肾脏等样品检测时的内标溶液；准确移取双氯芬酸-13C标准中间储备溶液1ml，置于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，配制成浓度为100ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液，作为脂肪样品检测时的内标溶液；准确移取双氯芬酸-13C标准中间储备溶液0.5ml，置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，配制成浓度为50ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液，作为牛奶样品检测时的内标溶液。2～8℃保存，有效期1个月。

　　5 仪器和设备

　　5.1液相色谱-串联质谱仪：电喷雾离子源（ESI）

　　5.2分析天平：感量为0.00001g

　　5.3天平：感量为0.001g

　　5.4氮吹仪或其他浓缩仪

　　5.5涡旋混匀仪

　　5.6组织匀浆机

　　5.7高速冷冻离心机

　　5.8恒温水浴锅

　　5.9超声波清洗仪

　　5.10具塞塑料离心管：10mL、15mL、50mL。

　　5.11 针筒过滤器：0.22μm，有机系。

　　5.12 可调微量移液器：1～10μl、20～200μl、100～1000μl。

　　6 试料的制备与保存

　　6.1 试料的制备

　　取适量牛的肌肉、肝脏、肾脏和脂肪，匀浆使均质；取适量新鲜的空白或供试牛奶，并使均质。

　　——取均质后的供试样品，作为供试试料。

　　——取均质后的空白样品，作为空白试料。

　　——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作溶液，作为空白添加试料。

　　6.2试料的保存

　　-20 ℃以下保存。

　　7 测定步骤

　　7.1 提取

　　肌肉、肝脏和肾脏 取供试试料（1.0±0.05）g于15mL离心管中，加入0.9%氯化钠溶液2mL，涡旋以使混悬，加入10μL浓度为500ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液，高速涡旋1min，静置10min，加入3mL乙酸乙酯，高速涡旋2min，4℃条件下4500g离心10min。

　　脂肪 取匀浆后的试料（2.0±0.05）g于15mL离心管中，于55℃水浴保温，使脂肪融化呈液体状，加入20μL浓度为100ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液，高速涡旋1min。加入提前温热的乙腈-乙酸乙酯溶液7mL至离心管中，55℃保温10min，使脂肪融化呈液体状，趁热高速涡旋1min，保温10min后，继续趁热涡旋1min；4℃条件下4500g离心10min。

　　牛奶 取试料（10±0.5）g于50mL离心管中，加入20μL浓度为50ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液，高速涡旋1min，静置10min后；加入10mL乙腈及1g乙酸铵，高速涡旋2min，4℃条件下4500g离心10min。

　　7.2 净化与浓缩

　　肌肉、肝脏和肾脏 将上清液转入10mL带盖聚丙烯离心管中，于50℃条件下浓缩至干，加入200μL流动相，涡旋振荡并水浴超声，使残渣完全溶解，经孔径为0.22μm的滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱分析。

　　脂肪 将上清液转移至50mL离心管中，加入用乙腈饱和过的正己烷5mL，涡旋混匀1min，25℃条件下以离心力4500g离心10min，弃去上层正己烷层；下层乙腈溶液转移至15mL离心管中，于50℃条件下浓缩至干，加入200μL流动相，涡旋振荡并水浴超声，使残渣完全溶解，经孔径为0.22μm的滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱分析。

　　牛奶 取上清液转入15mL带盖聚丙烯离心管中，加入用乙腈饱和过的正己烷3mL，涡旋混匀1min，25℃条件下以离心力4500g离心10min，弃去上层正己烷和下层水相；将乙腈提取液于50℃条件下浓缩至干，加入200μL流动相，涡旋振荡并水浴超声，使残渣完全溶解，经孔径为0.22μm的滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱分析。

　　7.3 标准曲线的制备

　　肌肉、肝脏及肾脏 分别移取双氯芬酸系列标准工作溶液适量于10mL容量瓶中，加入浓度为500ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液0.5mL，流动相定容至刻度，混匀，配制成双氯芬酸浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL，内标浓度均为25ng/mL的混合标准工作溶液，经孔径为0.22μm滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱分析。

　　脂肪 分别移取双氯芬酸系列标准工作溶液适量于10mL容量瓶中，加入浓度为100ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液1mL，流动相定容至刻度，混匀，配制成双氯芬酸浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL，内标浓度均为10ng/mL的混合标准工作溶液，经孔径为0.22μm滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱分析。

　　牛奶 分别移取双氯芬酸系列标准工作溶液适量于10mL容量瓶中，加入浓度为50ng/mL的双氯芬酸-13C标准工作溶液1mL，流动相定容至刻度，混匀，配制成双氯芬酸浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL和100ng/mL，内标浓度均为5ng/mL的混合标准工作溶液，经孔径为0.22μm滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱分析。

　　以双氯芬酸特征离子的质量色谱峰面积与内标特征离子的质量色谱峰面积的比值为纵坐标，双氯芬酸的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

　　7.4测定

　　7.4.1液相色谱参考条件

　　色谱柱：Agilent Eclipse plus C18色谱柱（3.0mm×50mm，1.8μm），或相当者；

　　流动相：0.1%甲酸乙腈溶液- 0.1%甲酸溶液（55∶45）；

　　流速：0.4mL/min；

　　进样量：肌肉、肝脏及肾脏 5μL，脂肪 10μL，牛奶20μL；

　　柱温：35℃；

　　运行时间：6min；

　　两次进样之间的平衡时间：3min。

　　7.4.2质谱参考条件

　　离子源：电喷雾离子源（ESI）；

　　扫描方式：正离子扫描；

　　检测方式：多离子反应监测（MRM）；

　　毛细管电压：+4000 V；

　　喷雾器压力：35psi；

　　干燥气温度：350℃；

　　干燥气流量（氮气）：10L/min；

　　电子倍增器电压增加值：+300V

　　待测药物定性离子对、定量离子对及对应的碎裂电压、碰撞能量、驻留时间的参考值见表1。

　　表1 双氯芬酸及内标定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量、驻留时间参考值

　　7.4.3 定性测定

　　在仪器最佳工作条件下，被测组分选择1个母离子和2个特征子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内，且样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度，与浓度接近的标准工作溶液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。

　　表2 液相色谱-串联质谱定性时相对离子丰度最大允许偏差

相对离子丰度，％	允许的相对偏差，％
>50	±20
>20～50	±25
>10～20	±30
≤10	±50

 　 7.4.4 定量测定

   在仪器最佳工作条件下，取试样溶液和相应的空白基质匹配的标准工作溶液，作单点或多点校准，按内标法以峰面积比计算。样品溶液中待测物的响应值比均应在标准曲线测定的线性范围内，对于超出标准曲线范围的样品，应以空白试料进行适当稀释后，重新处理检测。在上述色谱和质谱条件下，双氯芬酸和双氯芬酸-13C同位素内标对照品的多离子反应监测（MRM）色谱图参见附录A。

　　7.5回收率试验

　　空白试料中添加标准溶液，按照7.1～7.4操作，测定后计算样品添加的相对回收率。

　　7.6 平行试验

　　按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

　　7.7 空白试验

　　除不添加工作溶液外，均按上述步骤进行。

　　8 结果计算与表述

　　8.1 标准曲线校准

　　由标准曲线方程A双标/A内标 = a × C双标 + b，求得a和b，

　　试料中双氯芬酸残留量X（μg/kg），按下式计算：

　　X = (A双样/A内样 – b) ÷ a ÷ m

　　式中：

　　X—供试试料中双氯芬酸的残留量（μg/kg）；

　　A双标—制备标准曲线时双氯芬酸定量离子的峰面积；

　　A内标—制备标准曲线时双氯芬酸-13C定量离子的峰面积；

　　A双样—供试试料中双氯芬酸定量离子的峰面积；

　　A内样—供试试料中双氯芬酸-13C定量离子的峰面积；

　　C双标—制备标准曲线时双氯芬酸的加标浓度（ng/g）

　　m—供试试料质量（g）。

　　8.2 单点校准

　　试料中双氯芬酸残留量X（μg/kg），按下式计算：

　　X = A双样/A内样 × C双标 ÷ A双标/A内标 ÷ m

　　式中：

　　X—供试试料中双氯芬酸的残留量（μg/kg）；

　　A双样—供试试料中双氯芬酸定量离子的峰面积；

　　A内样—供试试料中双氯芬酸-13C定量离子的峰面积；

　　C双标—基质匹配的标准溶液中双氯芬酸的浓度（ng/g）；

　　A双标—基质匹配的标准溶液中双氯芬酸定量离子的峰面积；

　　A内标—基质匹配的标准溶液中双氯芬酸-13C定量离子的峰面积；

　　m—供试试料质量（g）。

　　注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。

　　9 检测方法灵敏度、准确度和精确度

　　9.1 灵敏度

　　本方法牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中双氯芬酸检测限均为0.3μg/kg，定量限均为0.5μg/kg；牛奶中双氯芬酸检测限为0.03μg/kg，定量限为0.05μg/kg。

　　9.2 准确度

　　本方法中牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶在LOQ、1/2MRL、MRL和2MRL添加浓度水平上的回收率为80%～120%。

　　9.3重复性

　　在重复性条件下，牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪和牛奶在LOQ、1/2MRL、MRL和2MRL添加浓度水平上的批内变异系数<20%，批间变异系数<20%。

　　附件6

　　磺胺氯吡嗪残留检测方法标准（试行）

　　鸡可食性组织中磺胺氯吡嗪残留量的测定高效液相色谱法（试行）

　　1.范围

　　本方法规定了鸡可食组织中磺胺氯吡嗪残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。

　　本方法适用于鸡的肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中磺胺氯吡嗪残留量的检测。

　　2.规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

　　GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。

　　3.方法原理

　　试样中磺胺氯吡嗪残留物用乙腈提取酸化后，经混合型阳离子交换反相吸附固相萃取小柱净化，氮气吹干，流动相溶解，用高效液相色谱法测定，外标法定量。

　　4.试剂和材料

　　以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

　　4.1 磺胺氯吡嗪钠对照品：纯度≥99.0％。

　　4.2 甲醇：色谱纯。

　　4.3 乙腈：色谱纯。

　　4.4 氨水。

　　4.5 盐酸。

　　4.6 磷酸二氢钾。

　　4.7 5 %氨化乙腈：准确吸取氨水5 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀即得。

　　4.8 0.1 mol/L盐酸水溶液：准确吸取37 %浓盐酸829 μL，置于100 mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀即得。

　　4.9 0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液：准确称取磷酸二氢钾2.7218 g，置于1000 mL容量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀即得。

　　4.10 复溶液：将乙腈和0.1 mol/L盐酸水溶液按50∶50（V/V）比例混匀，现配现用。

　　4.11 流动相：将乙腈和0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液按35∶65（V/V）比例混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤，超声脱气20 min。现配现用。

　　4.12 磺胺氯吡嗪标准储备液（1 mg/mL）：准确称取磺胺氯吡嗪钠对照品25 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定溶至刻度，摇匀即得。置-20 ℃条件下储存，有效期3个月。

　　4.13 磺胺氯吡嗪标准工作液：准确吸取适量磺胺氯吡嗪标准储备液，用流动相稀释成系列标准工作液。现用现配。

　　4.14 有机针式滤器（0.22 μm）。

　　4.15 MCX 固相萃取小柱，3 mL（60 mg），或相当者。

　　5. 仪器和设备

　　5.1 高效液相色谱仪。

　　5.2 涡旋振荡器。

　　5.3 冷冻离心机。

　　5.4 氮吹仪。

　　5.5 天平，感量 0.01 g。

　　5.6 分析天平，感量 0.000 01 g。

　　6. 样品的制备与保存

　　6.1 试料的制备

　　取适量新鲜或冷冻空白或供试组织，绞碎，并使均质。

　　——取新鲜或解冻的供试样品组织，作为供试试样。

　　——取新鲜或解冻的空白样品组织，作为空白试样。

　　——取新鲜或解冻的空白样品组织，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。

　　6.2 试料的保存

　　-20 ℃以下保存。

　　7. 测定步骤

　　7.1 提取

　　准确称取空白试样（2.0 ± 0.01）g，置于50 mL离心管中，加入3 g无水硫酸钠后，再加入5 %氨化乙腈9 mL；涡旋振荡3 min，超声10 min后；离心15 min（4 ℃,12000 r/min），将上清液移至50 mL离心管中。残渣用上述相同方法重复提取一次，合并上清液。

　　于上清液中加入5 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋振荡2 min，离心10 min（4 ℃,12000 r/min），弃去正己烷，保留下层液体备用。

　　取除脂后液体于40 ℃水浴氮气吹至近干，用1 mL复溶液溶解残渣，涡旋振荡1 min；加0.1 mol/L盐酸水溶液3 mL，涡旋振荡1 min，离心10 min（4 ℃,12000 r/min），取上清液备用，记为A液。残渣加0.1 mol/L盐酸水溶液3 mL涮洗离心管，涡旋振荡30 s，记为B液。

　　7.2 净化

　　MCX（60 mg/3 mL）小柱依次用甲醇3.0 mL活化，水3.0 mL平衡，将浓缩后上清液A液全部过柱；依次用7.1项下B液3.0 mL，甲醇1.0 mL淋洗；用5 %氨化乙腈6 mL洗脱，收集洗脱液于10 mL离心管，40 ℃水浴条件下氮气吹干，用1 mL流动相溶解已吹干的残渣，经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液供HPLC测定。

　　7.3 标准曲线的制备

　　准确量取磺胺氯吡嗪标准储备液适量，用流动相稀释，依次制备浓度为40、80、200、400、800、1600 ng/mL的磺胺氯吡嗪系列标准溶液。进行HPLC分析。

　　采用外标法进行计算，以磺胺氯吡嗪的浓度为横坐标，以磺胺氯吡嗪的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求出回归方程和相关系数。

　　7.4 测定

　　7.4.1 液相色谱条件

　　色谱柱：Kromasil C18柱（250 × 4.6 mm，5 μm）；或相当者；

　　流动相：乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾水溶液（35∶65，V/V）；

　　流速：1.0 mL/min；

　　柱温：35 ℃；

　　进样量：20 μL；

　　紫外检测波长：λ=272 nm。

　　7.4.2 测定法

　　按7.3项下方法制备标准曲线，计算线性方程及相关系数，按外标法计算。试样溶液中磺胺氯吡嗪的峰面积应在仪器检测的线性范围之内。

　　7.4.3 空白试验

　　采用与样品完全相同的测定步骤进行平行操作。

　　8. 结果计算

　　单点校准：

  　或标准曲线校准：由，求得a和b，则

　　按下式计算试样中磺胺氯吡嗪残留量：

　　式中：

　　C —— 试样溶液中磺胺氯吡嗪的浓度（μg/mL）；

　　Cs —— 标准工作液中磺胺氯吡嗪的浓度（μg/mL）；

　　A —— 试样品溶液中磺胺氯吡嗪的峰面积；

　　As —— 标准工作溶液中磺胺氯吡嗪的峰面积；

　　X —— 试样中磺胺氯吡嗪的残留量（mg/kg）；

　　V —— 残余物定容体积（mL）；

　　m —— 试样的重量（g）。

　　注：测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。1 μg/g = 1 mg/kg

　　9. 检测方法灵敏度、准确度和精密度

　　9.1 灵敏度

　　磺胺氯吡嗪在鸡肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中的检测限为20 μg/kg，定量限为40 μg/kg。

　　9.2 准确度

　　本方法在鸡肌肉、肝脏、肾脏和脂肪添加浓度为40 μg/kg ～ 200 μg/kg时的回收率均为60 % ～ 100 %。

　　9.3 精密度

　　本方法的批内相对标准偏差≤10 %，批间相对标准偏差≤15 %。

附录A

（资料性附件）

磺胺氯吡嗪特征色谱图

 

 

 图A.1  磺胺氯吡嗪标准品（0.2μg/ml）

 

图A.2-1  鸡肝脏组织空白试样

 

图A.2-2  鸡肝脏组织空白添加磺胺氯吡嗪试样（100μg/kg）