中华人民共和国农业农村部公告 第130号

根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定，经审查，批准华中农业大学等14家单位申报的牛结核病γ-干扰素ELISA检测试剂盒等5种兽药产品为新兽药，核发《新兽药注册证书》，发布产品试行规程、质量标准、说明书和内包装标签，自发布之日起执行。

　　特此公告。

　　附件：1.新兽药注册目录

　     　 2.试行规程

　     　 3.质量标准

　　      4.说明书和内包装标签

农业农村部

2019年1月23日

附件1 

新兽药注册目录

附件2（略）

附件3（略）

附件4

牛结核病γ-干扰素ELISA检测试剂盒等5种兽药产品说明书和内包装标签

一、牛结核病γ-干扰素ELISA检测试剂盒说明书和内包装标签

（一）牛结核病γ-干扰素ELISA检测试剂盒说明书

兽用

【兽药名称】

通用名  牛结核病γ-干扰素ELISA检测试剂盒

商品名  无

英文名  Bovine Tuberculosis IFN-γ ELISA Test Kit

汉语拼音  Niujiehebing γ-ganraosu ELISA Jiance Shijihe

【主要组份与含量】

【作用与用途】  用于牛结核病的辅助诊断。

【用法与判定】

1  样本制备  待检样本按如下方法制备：

1.1  采血  无菌采集牛结核病阳性或阴性牛全血5ml，肝素钠抗凝，室温条件下36小时内送达实验室进行刺激培养。培养试验开始前准备无菌清洁的2ml平底离心管和无菌PBS。

1.2  血液分装  分装前应将装有抗凝血的采血管上下轻轻颠倒5～10次，充分混匀血液样本。将每份抗凝血加入3个2ml离心管中，1ml/管。

1.3  抗原刺激  将牛结核菌素（bPPD）、禽结核菌素（aPPD）工作液（2种刺激抗原）和 PBS（无刺激抗原对照）各100μl分别按无菌操作加入1.2项中的3支离心管中。盖严，轻轻摇动离心管，使血液与刺激抗原或PBS充分混合，置37℃培养箱中培养16～20小时，取上清，得到该头牛的3份待检样本，即2种抗原刺激的血液培养上清和PBS血液培养上清。 

1.4  样本贮存  如果不立即检测上述血液培养上清，可收集后低温保存，检测时先将样本恢复至室温。上清在2～8℃可保存7日，在-20℃以下可保存3个月。

2  试剂配制（临用前配制）

2.1  PBS（0.01mol/L，pH值7.4，下同）：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠（含12个结晶水）2.9g、磷酸二氢钾0.2g，加蒸馏水800ml溶解，用1mol/L的氢氧化钠溶液和1mol/L的盐酸溶液调pH值至7.4，加蒸馏水定容至1000ml，经121℃高压灭菌20分钟，冷却备用。

2.2  结核菌素工作液配制  使用前，将牛结核菌素（bPPD）和禽结核菌素(aPPD)做5倍稀释，即结核菌素与无菌PBS按1：4比例混合。

2.3  洗涤液配制  使用前，将20倍浓缩洗涤液恢复至室温（20～25℃），并摇动混匀（也可在37℃水浴中加热5～10分钟），然后用蒸馏水作20倍稀释，混匀，置2～8℃，可保存7日。

3  操作步骤

3.1  取出单抗包被板，平衡至室温（根据样本多少，可拆开分次使用），按样本布局表（以90份样本为例）加入刺激后的血液培养上清样本，100μl/孔；另外设阳性对照（PC）、阴性对照（NC）各2孔，100μl/孔。置37℃孵育45分钟。

样本布局表

注：“S1～S30”表示“样本编号1～30”，每头待检动物包括三份样本，即：牛结核菌素培养上清（简称“bPPD”）；禽结核菌素培养上清（简称“aPPD”）；PBS培养上清（简称“PBS”）；“PC”表示“阳性对照”；“NC”表示“阴性对照”；“/”表示“不加样”。

3.2  甩掉板孔中的液体，用洗涤液洗板3次，300μl/孔，每次静置1分钟后倒掉，最后一次拍干。

3.3  加入兔抗牛γ-干扰素多克隆抗体，100μl/孔，置37℃孵育30分钟。

3.4  洗板3次，方法同3.2。

3.5  加入羊抗兔酶标二抗，100μl/孔，置37℃孵育30分钟。

3.6  洗板5次，方法同3.2。

3.7  每孔先加入50µl底物溶液A，再加入50µl底物溶液B，混匀，置室温避光显色10分钟。

3.8  每孔加入50µl终止液，10分钟内在酶标仪上测定各孔OD_630nm值。

4  结果判定

4.1  试验成立的条件为：阳性对照（PC）的OD_630nm值均应≥1.0，阴性对照（NC）的OD_630nm值均应＜0.2。

4.2  bPPD血液培养上清孔OD_630nm值记作OD_bPPD，aPPD血液培养上清孔OD_630nm值记作OD_aPPD，PBS血液培养上清孔OD_630nm值记作OD_PBS。计算OD^bPPD、OD_aPPD及OD_PBS之间的差值；OD_bPPD-OD_PBS≥0.2且OD_bPPD-OD_aPPD≥0.2判为牛结核病阳性；其它情形均判为牛结核病阴性。

【注意事项】（1）试剂用前应恢复至室温，液体试剂应充分摇匀，用后放2～8℃保存。

（2）20倍浓缩洗涤液使用前务必摇匀使盐沉淀充分溶解。

（3）酶标板拆封后应避免受潮。

（4）底物溶液和终止液不能暴露于强光或接触氧化剂。

（5）不同批号试剂盒的试剂组分不能混用。

（6）试验完毕，应将相关材料高压消毒后再按实验室常规废弃物处理。

【规格】  192孔/盒

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产文号】

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

（二）牛结核病γ-干扰素ELISA检测试剂盒内包装标签

兽用

牛结核病γ-干扰素ELISA检测试剂盒

192孔/盒                                                批准文号：

                                                            批    号：

                                                            有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【作用与用途】  用于牛结核病的辅助诊断。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

单抗包被板

兽用

96孔/板                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

牛结核菌素

兽用

1.2ml/管                                                批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

禽结核菌素

兽用

1.2ml/管                                                批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

阳性对照

兽用

1ml/管                                                  批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

  阴性对照

兽用

1ml/管                                                  批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

兔抗牛γ-干扰素多克隆抗体

兽用

20ml/瓶                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

羊抗兔酶标二抗

兽用

20ml/瓶                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

20倍浓缩洗涤液

兽用

45ml/瓶                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

底物溶液A

兽用

10ml/瓶                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

底物溶液B

兽用

10ml/瓶                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

终止液

兽用

10ml/瓶                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与用量】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为10个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

    二、牛结核病IFN-γ夹心ELISA检测试剂盒说明书和内包装标签

（一）牛结核病IFN-γ夹心ELISA检测试剂盒说明书

兽用

【兽药名称】                                               

通用名  牛结核病IFN-γ夹心ELISA检测试剂盒

商品名  无

英文名  Bovine Tuberculosis IFN–γ Sandwich ELISA Test Kit

汉语拼音  Niu Jiehebing γ-Ganraosu Jiaxin ELISA Jianceshijihe

【主要成分及含量】

【作用与用途】  用于检测牛血浆中的IFN-γ，用于牛结核病的辅助诊断。

【用法与判定】

1  用法

1.1  样品准备  无菌采集实验牛颈静脉血放于肝素锂抗凝采血管，轻轻颠倒混匀后，分装至24孔细胞培养，分装至3个细胞培养孔，每孔1.5ml；然后将PPDB 3000和PPDA 2500分别用无菌PBS（0.01mol/L，pH值7.2～7.4）稀释10倍（1ml PPDB 3000或PPDA 2500加入9ml PBS），分别加入100μl 10倍稀释后的PPDB、PPDA和PBS，轻轻振荡混匀，置37℃、含5%CO2培养24小时，收集上清，备用。吸取抗凝血或刺激原至24孔细胞培养板的推荐操作示意图如下：

    注：表中PPBD为PPBD 3000的缩写代号；PPDA为PPDA 2500的缩写代号。

1.2  试剂盒准备

1.2.1 将试剂盒中溶液（100×HRP-抗牛IFN-γ单抗、阳性对照和阴性对照除外）从2～8℃取出后恢复至室温。

1.2.2  1×洗涤液的配制 使用前，将20×洗涤液恢复至室温，（可在37℃水浴中加热5～10分钟使结晶溶解），然后用双蒸水作20倍稀释（10ml 20×浓缩洗涤液加入190ml双蒸水），充分混匀。

1.3  加样 取单抗包被板（根据样品多少，可拆开分次使用），每孔先加入50µl样品稀释液，再分别加入50µl检测样品（包括PPDB、PPDA和PBS刺激样品，及阴、阳性对照）充分混匀，封板，22～25℃避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入250μl 1×洗涤液，洗涤6次，最后1次轻轻拍干。加样操作示意图如下：

    注：表中PPBD为PPBD 3000的缩写代号；PPDA为PPDA 2500的缩写代号。

1.4  加入酶标抗体  用酶标抗体稀释液100倍稀释100×HRP-抗牛IFN-γ单抗（现配现用，1ml 100×HRP-抗牛IFN-γ单抗加入99ml酶标抗体稀释液），100μl/孔，22～25℃避光反应60分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入250μl 1×洗涤液，洗涤6次，最后1次轻轻拍干。

1.5  显色与终止  加入底物显色液，100μl/孔，从加入第1孔即开始计时，22～25℃避光反应30分钟。按底物显色液加入顺序，向各孔依次加入50µl终止液，轻轻混匀，10分钟内用酶标仪测定OD_450nm值。

2  结果判定

2.1  试验成立条件  阴性对照OD_450nm值≤0.15，阳性对照OD_450nm值≥1.0。

2.2  判定方法  PPDB 3000、PPDA 2500和PBS刺激样品的OD_450nm值分别记作OD_450nm值_(PPDB)、OD_450nm值_(PPDA)、OD_450nm值_(PBS)。当OD_450nm值_(PPDB)－OD_450nm值(PBS)≥0.1，且OD_450nm值_(PPDB)-OD_450nm值_(PPDA)≥0.1时，则判为牛结核病阳性；当OD_450nm值_(PPDB)-OD_450nm值_(PBS)＜0.1，或OD_450nm值_(PPDB)-OD_450nm值_(PPDA)＜0.1时，则判为牛结核病阴性。

【注意事项】  （1）本试剂盒仅供体外检测使用。

（2）严格按照说明书操作，不同批号组分不得混用。

（3）所有试剂一律于2～8℃保存，使用前恢复至室温（100×HRP-抗牛IFN-γ单抗、阳性对照和阴性对照除外）。单抗包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

（4）样品若在5日内进行检测可储存于2～8℃，否则应保存于-20℃以下，避免反复冻融。冷冻样品试验前需融化并摇匀。

（5）加样时应尽量避免起泡及液体溅出，避免样本间相互污染。

（6）底物溶液应避光保存，避免与氧化剂接触，盛装底物溶液的容器应保持干净。

（7）终止液为1mol/L的盐酸溶液，具有腐蚀作用，避免接触眼睛和皮肤。

（8）实验过程中注意生物安全，相应材料使用完毕后应进行无害化处理。

【规格】  （1）96孔/盒 （2）192孔/盒 （3）480孔/盒 （4）960孔/盒

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【批准文号】

【生产企业】

（二）牛结核病IFN-γ夹心ELISA检测试剂盒内包装标签

牛结核病IFN-γ夹心ELISA检测试剂盒

兽用

    96（192、480、960）孔/盒                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

    【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

单抗包被板

兽用

96孔/板                                                  批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

100×HRP-抗牛IFN-γ单抗

兽用

0.2（0.4、1、2）ml/支                                    批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

PPDB 3000

兽用

0.5（1、2.5、5）ml/瓶                                    批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

PPDA 2500

兽用

0.5（1、2.5、5）ml/瓶                                    批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

阳性对照

兽用

0.5（1、2.5、5）ml/瓶                                    批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

阴性对照

兽用

0.5（1、2.5、5）ml/瓶                                    批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

样品稀释液

兽用

6（12、30、60）ml/瓶                                     批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

酶标抗体稀释液

兽用

12（25、60、120）ml/瓶                                   批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

20×浓缩洗涤液

兽用

15（30、75、150）ml/瓶                                   批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

底物显色溶液

兽用

12（25、60、120）ml/瓶                                   批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

终止液

兽用

6（12、30、60）ml/瓶                                     批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

    三、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗说明书和内包装标签

（一）猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗说明书

兽用

【兽药名称】

通用名  猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗

商品名  无

英文名  Streptococcus suis，Haemophilus parasuis Combined Subunit Vaccine

汉语拼音  Zhulianqiujunbing，fuzhushixueganjunbing Er lian Yadanwei Yimiao

【主要成分及含量】  含猪链球菌免疫蛋白（HP0197和HP1036）和副猪嗜血杆菌免疫蛋白（06257和palA），按蛋白浓度计算疫苗中每种蛋白含量≥500μg/头份。

【性状】  乳白色乳剂。

【作用与用途】  用于预防由猪链球菌2型、7型感染引起的猪链球菌病和副猪嗜血杆菌4型、5型感染引起的副猪嗜血杆菌病。免疫期为5个月。

【用法与用量】  使用前使疫苗平衡至室温并充分摇匀，颈部肌肉注射，每次每头猪均肌肉注射2ml。推荐免疫程序为：种公猪每半年接种1次；后备母猪在产前8～9周首免，3周后二免，以后每胎产前4～5周免疫1次；仔猪在2周龄首次免疫，3周后二免。。

【不良反应】  疫苗注射后可能引起轻微体温反应，但不引起流产、死胎、畸形胎等不良反应，由于个体差异或者其它原因（如营养不良、体弱发病、潜伏感染、寄生虫感染、运输或环境应激、免疫机能减退等），个别猪在注射后可能出现过敏反应，可用抗过敏药物（如地塞米松、肾上腺素等）进行治疗，同时采用适当的辅助治疗措施。

【注意事项】 

（1）仅用于健康猪。

（2）疫苗贮藏及运输过程中切勿冻结，长时间暴露于高温下会影响疫苗效力，使用前使疫苗平衡至室温并充分摇匀。

（3）使用前应仔细检查包装，如发现破损、残缺、文字模糊、过期失效等，则禁止使用。

（4）注射器具应严格消毒，每头猪更换1次针头，接种部位严格消毒后进行深部肌肉注射，若消毒不严或注入皮下易形成永久性肿包，并影响免疫效果。

（5）禁止与其他疫苗合用，接种同时不影响其它抗病毒类、抗生素类药物的使用。

（6）启封后应在8小时内用完。

（7）屠宰前1个月禁用。

【规格】  （1）4ml/瓶 （2）6ml/瓶 （3）20ml/瓶（4）50ml/瓶  （5）100ml/瓶

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为18个月。

【批准文号】

【生产企业】 

仅在兽医指导下使用

    （二）猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗内包装标签

兽用

猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗

4（6、20、50、100）ml/瓶                                 批准文号：

                                                              生产批号：

                                                              有效期至：

详见说明书。

【作用与用途】  用于预防由猪链球菌2型、7型感染引起的猪链球菌病和副猪嗜血杆菌4型、5型感染引起的副猪嗜血杆菌病。免疫期为5个月。

【用法与用量】  颈部肌肉注射，2ml/头份。使用及注意事项详见说明书。

【贮藏与有效期】  2～8℃保存，有效期为18个月。

【生产企业】

仅在兽医指导下使用

    四、猪链球菌病活疫苗（SS2-RD株）说明书和内包装标签

（一）猪链球菌病活疫苗（SS2-RD株）说明书

兽用

【制品名称】

通用名  猪链球菌病活疫苗（SS2-RD株）

商品名  无

英文名  Swine Streptococcosis Vaccine，Live（Strain SS2-RD）

汉语拼音  Zhu Lianqiujunbing Huoyimiao（SS2-RD Zhu）

【主要成分及含量】  主要含猪链球菌血清2型SS2-RD弱毒菌株的培养物，每头份疫苗含活菌不低于5.0×10^8.0 CFU。

【性状】  淡棕色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

【作用与用途】  用于预防猪链球菌2型引起的猪链球菌病，免疫期为6个月。

【用法与用量】  颈部肌肉注射。按瓶签注明头份用20%氢氧化铝胶生理盐水进行稀释，接种1月龄左右的健康猪，每头1头份。

【不良反应】  疫苗注射后一般不会引起明显体温升高，不会引起流产、死胎、畸形胎等不良反应，由于个体差异或者其它原因（如营养不良、体弱发病、潜伏感染、寄生虫感染、运输或环境应激、免疫机能减退等），个别猪在注射后可能出现过敏反应，可用抗过敏药物（如地塞米松、肾上腺素等）进行治疗，同时采用适当的辅助治疗措施。

【注意事项】  （1）仅用于健康猪。

（2）疫苗在运输、保存、使用过程中应防止高温、消毒剂和阳光照射。

（3）应使用无菌注射器进行接种。

（4）应对注射部位进行严格消毒。

（5）禁止与其它活疫苗同时使用，禁止接种前后7天内使用抗生素类药物。

（6）疫苗稀释后充分摇匀，限2小时内用完。

（7）用过的疫苗瓶、器具和未用完的疫苗等应进行无害化处理。

【规格】  （1）5头份／瓶  （2）10头份／瓶  （3）20头份／瓶

【包装】  （1）5头份／瓶×10瓶／盒  （2）10头份／瓶×10瓶／盒  （3）20头份／瓶×10瓶／盒

【贮藏与有效期】  －15 ℃以下保存，有效期为15个月。

【批准文号】

【生产企业】 

仅在兽医指导下使用

    （二）猪链球菌病活疫苗（SS2-RD株）内包装标签

兽用

猪链球菌病活疫苗（SS2-RD株）

5（10、20）头份／瓶 

批准文号：

生产批号：

有效期至：

    【作用与用途】  用于预防猪链球菌2型引起的猪链球菌病，免疫期为6个月。

【用法与用量】  使用及注意事项详见说明书。

【贮藏与有效期】  －15 ℃以下保存，有效期为15个月。

【生产企业】

仅在兽医指导下使用

    五、非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书和内包装标签

（一）非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书

兽用

【兽药名称】

通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

汉语拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名称：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名称：无

【主要成分与含量】

【作用与用途】  用于血液、血球粉、淋巴结、脾脏、扁桃体中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

【用法与判定】 

1 用法

1.1 样品处理

血液样品直接用；淋巴结、脾脏、扁桃体样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH7.2，含1万单位青霉素和1万单位链霉素）混匀（样品不足2.0g按1：5比例加PBS），对处理的待检样品置70℃，30分钟灭活后，3 000 r/min，4℃离心5分钟，取上清液，编号备用；血球粉处理同上，只不过省掉研磨步骤。

1.2 样品存放

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

1.3 操作步骤

1.3.1 病毒DNA的提取（使用A盒）

（1）待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌的1.5 mL离心管，逐管编号。

（2）每管加入Buffer A 500mL。

（3）每管分别加入已处理的待检样品、阳性对照、阴性对照各200mL，充分混匀，室温放置10分钟。

（4）取与上述离心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，编号。将离心管中的溶液转移至DNase-Free吸附柱，（为避免堵塞吸附柱，尽量不要吸悬浮杂质）。

（5）13000 r/min室温离心30秒。

（6）弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中。

（7）吸附柱内加入600 mL Buffer B，13000 r/min离心30秒。

（8）弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中。

（9）重复步骤（7），（8）。

（10）13000 r/min空柱离心2分钟，去除残留液。

（11）将每个吸附柱分别移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入50mL Buffer C，室温静置1分钟，13000 r/min离心30秒，离心管中液体即为模板DNA。获得的DNA溶液，冰上保存备用（注意提取的DNA须在2 h内进行PCR 扩增，若需长期保存须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融）。

1.3.2 荧光PCR扩增（使用B盒）

（1）从试剂盒中取出荧光PCR反应液、Taq酶，室温融化后，2 000 r/min离心5秒。设所需PCR管数为n（n = 样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系需要20mL 荧光PCR反应液和0.5mL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装20mL。

（2）分别向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制备的DNA溶液各5mL，盖紧管盖，500 r/min 离心30秒。

（3）将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。反应参数设置：

第一阶段，预变性95℃/3分钟

第二阶段，95℃/15秒，52℃/10秒，60℃/35秒共45个循环。荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。

2 判定

2.1 结果分析条件的设定 

阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。对于多通道荧光PCR仪，选定FAM(465-510)检测通道读取检测结果，ABI仪器选择FAM无荧光淬灭基团。

2.2 质控标准

2.2.1 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。

2.2.2 阳性对照的Ct值应小于等于28，并出现典型的扩增曲线。

2.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。

2.3 结果判定

2.3.1 阴性：无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。

2.3.2 阳性：Ct值≤38.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性。

2.3.3 Ct值大于38.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳性，否则判为阴性。

【注意事项】

1 实验室应至少分三个区：样品处理区、反应混合物配制区和检测区。

2 各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染。检测结束后，应立即对工作台进行清洁。

3 Buffer A有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣服上，否则应立即用大量清水冲洗并擦干。

4 在整个检测过程中应注意避免交叉污染：提取核酸时应用灭菌的镊子夹取离心管；对离心管开盖时应避免粘在手上或溅出，否则要立即更换手套。

5 反应液在使用前要彻底融化，并将反应液与Taq酶瞬时离心将液体甩至管底。分装反应液时，应尽量避免产生气泡。上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。

6 阳性对照在吸取前应在微量漩涡振荡器上剧烈振荡1～2秒。

7 试剂盒中各组分应避免反复冻融。

8 对样品及其废弃物的操作应严格遵守生物安全规定。

9 本试剂盒仅供兽医及相关专业人士使用。

【贮藏与有效期】  非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的A盒室温保存，B盒在-20℃保存，有效期为12个月。

【规格】  48检测/盒

【批准文号】 

【生产企业】 

仅供兽医诊断使用

    （二）非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒内包装标签

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（A盒）

兽用

48检测/盒                                                批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 室温保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（B盒）

兽用

48检测/盒                                                批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 -20℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

  Buffer A

兽用

25 mL/瓶                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 室温保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

Buffer B

兽用

60 mL/瓶                                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 室温保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

Buffer C

兽用

1250 μL/管                                              批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 室温保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

荧光PCR反应液

兽用

1000 μL/管                                              批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 -20℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

Taq酶

兽用

30 μL/管                                                批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 -20℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

阳性对照

兽用

1000 μL/管                                              批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 -20℃保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

阴性对照

兽用

1000 μL/管                                              批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】 详见说明书。

【贮藏与有效期】 -20℃，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用