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基因编辑技术在家畜育种中的研究进展
日期：2018-04-24 15:55
作者：徐嘉威，贺花，沈雪梅，刘鲲鹏，雷初朝，陈宏，黄永震
来源：《基因组学与应用生物学》
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摘要：基因编辑技术可以从分子水平上对某个基因进行定点修饰，就可用来改良动物性状，所以其在动物育种中也起到巨大的作用。
基因编辑技术是在DNA水平上对遗传进行修改的。相对于RNA干扰(RNAi)、蛋白质阻断剂等技术而言，可以带给生物体长久的可遗传的变异。现在主导的基因编辑技术的核酸酶包括锌指蛋白核酸酶(zinc-fingernucleases,ZFNs)、转录激活子样效应核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)和通过sgRNA引导的CRISPR/Cas9核酸酶。基因编辑技术的用途广泛，包括基因功能研究、基因治疗、制作抗体药物、构建模式动物、改造和培育新品种等。但目前基因编辑技术主要在医学上运用，在家畜上的运用不多。应用基因编辑技术可对家畜的生产性能进行从分子水平上的改善，还可以培育出抗病性良好的多种家畜等，在育种上发挥了极大的作用。
一、在家畜上的应用
1、牛
Richt等(2007)敲除了牛的PRNP基因，使其脑部的PrPC蛋白表达显著下降，对朊蛋白造成的疯牛病起到了有效的预防。Yu等(2011)在应用ZFN技术敲除牛乳中具有致敏性的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)基因，提高了牛奶的营养价值。Jeong等(2016)借助CRISPR/Cas9技术将人成纤维细胞生长因子2(humanfibroblastgrowthfactor2,hFGF2)基因导入到牛成纤维细胞的β-casein基因内含子中，对牛囊胚进行体细胞核移植，在细胞和胚胎水平上均检测到hFGF2基因的表达，为最终得到表达人成纤维细胞生长因子2的基因编辑牛奠定了基础。
有研究表明BMP15和GDF9基因在雌性动物的卵泡发育过程中发挥重要作用，冯万友(2015)利用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术突变水牛BMP15和GDF9基因，提出了提高水牛繁殖性能的可行性。高旭建(2016)在牛上利用CRISPR/Cas9介导的同源打靶技术,对乳腺特异性表达人胰岛素的转基因动物制备进行了初步研究。在国内对牛Myostatin基因敲除已有一些研究进展，肌肉生长抑制素(MSTN)基因的表达可抑制肌细胞的增殖与分化，通过对MSTN基因的敲除可引起动物表现“双肌”性状，对肉牛等肉用家畜的培育起到极大帮助。Wu等(2015)开发利用TALE切口酶技术将小鼠的SP110基因敲入到牛的常染色体中，得到了23头转基因牛。
随后经过体内和体外的转染实验，证明了SP110转基因牛可有效的抵抗牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)的侵袭，大大提高了牛对结核病的抗性。通过检测其后代的抗性，证明了该基因可遗传。Gao等(2017)又首次利用CRISPR/Cas9n技术将NRAMP1(naturalresistance-associatedmacrophageprotein-1,NRAMP1)基因敲入奶牛的基因组中，获得了抗M.bovis的11头转基因奶牛。经检测11头奶牛均未检测到发生脱靶效应，证明了应用这种新型CRISPR技术可减少消除脱靶效应，为研究更多转基因家畜提供了可能。
2、羊
熊锴(2013)利用锌指核酸酶技术敲除了奶山羊BLG基因。Ni等(2014)选择MSTN(myostatin)、核孔蛋白155(Nucleoporin155,NUP)、BLG和朊蛋白(prionprotein,PrP)基因作为靶基因，利用CRISPR/Cas9技术，对山羊原代成纤维细胞进行了单个基因的单/双等位基因敲除以及4个基因的同步敲除，对山羊多种有益于人类的多种性状进行改善。2015年，Cui等(2015)利用TALEN将人乳铁蛋白(humanlactoferrin,hLF)替换了羊的β乳球蛋白，提高了羊奶的营养价值。皮文辉等(2015)通过构建TALENs电转染至绵羊成纤维细胞中，经检测完成了FGF5基因在绵羊成纤维细胞中的起始密码子ATG定点敲除，为进一步验证绵羊FGF5基因与羊毛毛长的关系打下基础。
随后，阿力玛(2016)和李佳鑫(2016)等分别利用CRISPR/Cas9技术敲除绒山羊FGF5基因，为培育出高产绒的FGF5基因编辑绒山羊奠定基础。李聪和曹广文(2015)成功应用CRISPR/Cas9系统对绵羊MSTN基因进行敲除，证明该系统可以对于绵羊基因编辑，研究产生的突变细胞系为制备MSTN基因敲除羊提供了材料。刘健(2015)利用CRISPR/Cas9技术对绒山羊的胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞中MSTN基因成功进行敲除。
2016年，影响绵羊毛色ASIP基因编辑产生不同毛色的绵羊在新疆诞生。Fat-1基因表达为ω-3脂肪酸脱氢酶，可使脂肪酸由ω-6形式转变为ω-3，从而有益于调整动物机体内部脂类代谢。张驹等(2016)通过CRISPR/Cas9编辑技术成功敲除了山羊的MSTN基因，并且在该位点中插入Fat-1基因的载体，用电转染法将目的基因转至绒山羊胎儿成纤维细胞中，依靠体细胞核移植法来制备转Fat-1基因绒山羊，希望选育出既增加羊肉产量又同时提升羊肉中ω-3含量的山羊新品种。
3、猪
在猪到人异种移植中会引起超急性移植排斥反应。Hauschild等(2011)利用ZFN获得了α-1,3-半乳糖基因敲除猪，为器官移植手术中产生的超急性免疫排斥反应的应对提供了思路。Yang等(2011)研究中将ZFN技术与体细胞核移植技术组合，制备出过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ基因定点突变的敲除猪，有利于研究PPARγ基因在人脑血管疾病中的作用。Hauschild等(2011)又进一步使用锌指核酸酶技术完成了猪的GGTA1基因的双等位基因突变，并且发现通过该技术可只经一代的体外核移植得到敲除该双等位基因的纯合基因型。Carlson等(2012)在猪的细胞中实现了TALEN技术介导的多种基因敲除，表明了TALEN技术在猪上应用趋于成熟。
Li等(2014)在猪的基因组中发现了一个ROSA26基因位点，并用TALEN介导的基因编辑技术可进行定点重组酶介导的基因敲入，有助于解决转基因猪表型不一的问题。阮进学(2015)研究根据基因组编辑技术针对猪H11位点创建了一个高效的定点整合系统，使更为高效安全的制备转基因猪成为可能。Hai等(2014)对猪的vWF基因构建CRISPR/Cas9系统和显微注射技术组合一步就成功进行编辑，vWF基因突变的表型出血十分严重，为治疗血管性血友病提供了相似的模型，证明了CRISPR/Cas9技术在大动物模型构建中的高效性。Marron等(2013)研究发现通过ZFN技术敲除猪的MSTN基因，破坏肌肉生长抑制素的合成，可明显提高猪的瘦肉率。
我国也有许多研究表明应用编辑MSTN基因可培育出含有“双肌”性状的优良猪种群。郭仕妹(2016)首次利用CRISPR/Cas9技术和ssODN成功模拟MSTN基因自然突变，为获得肌肉表型更明显的克隆猪奠定了基础。另外，由于这种基因编辑猪的突变类型是在动物中自然存在的，并已经用于畜牧业生产。因此，通过我们这种模拟自然突变建立的高生产性能猪更容易被人们接受。康难难等(2016)利用显微注射法将sgRNA和Cas9mRNA注入猪孤雌胚胎，敲除了B2M和CIITA基因，使之主要组织相容性复合体I类与II类分子失去生物活性，进而可抑制T细胞在免疫反应中的强度，成功的实现利用猪单个胚胎进行高效快速的CRISPR/Cas9打靶位点检测。王敏等(2017)研究发现，RGS双荧光替代性报告载体的使用可以有效提高CRISPR/Cas9在猪胚胎成纤维细胞中对BMP15基因的打靶效率，为今后通过体细胞核移植技术培育BMP15基因编辑猪，提高母猪繁育能力提供依据。
二、存在的问题及发展前景
基因编辑技术发展至今已达到一定的高度，在建立动物疾病模型、培育新动物品种和治疗遗传疾病等方面有着巨大潜力。但在降低脱靶率、提高特异性以及效率等方面还有不足，CRISPR/Cas9技术虽然比其他技术更为经济快捷效率高，但在应用于不同对象上时，还应注意使用不同的方法，怎样完善基因编辑技术降低其脱靶率、提高特异性、增强其普适性成为当前应解决的问题，是否有更为有效的基因编辑技术还有待进一步研究。
三大基因编辑技术在家畜育种中起到了重要的作用，通过基因的敲除(knockout)或敲入(knockin)改变家畜的生产性状，使之向对人类有益的方向发展。基因组编辑技术被认定成一种理想的基因改造工具，因其效率高、对基因的修饰精确度高而被用于大量的研究。随着以基因编辑技术为基础的选择友好位点、连接多基因、表观调控等应用的完善，今后动物育种将有可能向规模化、多基因改良的方向发展。经过基因编辑的畜禽可促进畜牧业经济的发展，为提高人们营养水平和生活质量服务。由此可知，基因编辑技术已成为现代生物研究的重要手段之一，为了更好地为科学研究提供良好的平台，完善发展基因编辑技术成为了重中之重。
基因编辑技术是在DNA水平上对遗传进行修改的。相对于RNA干扰(RNAi)、蛋白质阻断剂等技术而言，可以带给生物体长久的可遗传的变异。现在主导的基因编辑技术的核酸酶包括锌指蛋白核酸酶(zinc-fingernucleases,ZFNs)、转录激活子样效应核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)和通过sgRNA引导的CRISPR/Cas9核酸酶。基因编辑技术的用途广泛，包括基因功能研究、基因治疗、制作抗体药物、构建模式动物、改造和培育新品种等。但目前基因编辑技术主要在医学上运用，在家畜上的运用不多。应用基因编辑技术可对家畜的生产性能进行从分子水平上的改善，还可以培育出抗病性良好的多种家畜等，在育种上发挥了极大的作用。
一、在家畜上的应用
1、牛
Richt等(2007)敲除了牛的PRNP基因，使其脑部的PrPC蛋白表达显著下降，对朊蛋白造成的疯牛病起到了有效的预防。Yu等(2011)在应用ZFN技术敲除牛乳中具有致敏性的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)基因，提高了牛奶的营养价值。Jeong等(2016)借助CRISPR/Cas9技术将人成纤维细胞生长因子2(humanfibroblastgrowthfactor2,hFGF2)基因导入到牛成纤维细胞的β-casein基因内含子中，对牛囊胚进行体细胞核移植，在细胞和胚胎水平上均检测到hFGF2基因的表达，为最终得到表达人成纤维细胞生长因子2的基因编辑牛奠定了基础。
有研究表明BMP15和GDF9基因在雌性动物的卵泡发育过程中发挥重要作用，冯万友(2015)利用CRISPR/Cas9靶向基因编辑技术突变水牛BMP15和GDF9基因，提出了提高水牛繁殖性能的可行性。高旭建(2016)在牛上利用CRISPR/Cas9介导的同源打靶技术,对乳腺特异性表达人胰岛素的转基因动物制备进行了初步研究。在国内对牛Myostatin基因敲除已有一些研究进展，肌肉生长抑制素(MSTN)基因的表达可抑制肌细胞的增殖与分化，通过对MSTN基因的敲除可引起动物表现“双肌”性状，对肉牛等肉用家畜的培育起到极大帮助。Wu等(2015)开发利用TALE切口酶技术将小鼠的SP110基因敲入到牛的常染色体中，得到了23头转基因牛。
随后经过体内和体外的转染实验，证明了SP110转基因牛可有效的抵抗牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)的侵袭，大大提高了牛对结核病的抗性。通过检测其后代的抗性，证明了该基因可遗传。Gao等(2017)又首次利用CRISPR/Cas9n技术将NRAMP1(naturalresistance-associatedmacrophageprotein-1,NRAMP1)基因敲入奶牛的基因组中，获得了抗M.bovis的11头转基因奶牛。经检测11头奶牛均未检测到发生脱靶效应，证明了应用这种新型CRISPR技术可减少消除脱靶效应，为研究更多转基因家畜提供了可能。
2、羊
熊锴(2013)利用锌指核酸酶技术敲除了奶山羊BLG基因。Ni等(2014)选择MSTN(myostatin)、核孔蛋白155(Nucleoporin155,NUP)、BLG和朊蛋白(prionprotein,PrP)基因作为靶基因，利用CRISPR/Cas9技术，对山羊原代成纤维细胞进行了单个基因的单/双等位基因敲除以及4个基因的同步敲除，对山羊多种有益于人类的多种性状进行改善。2015年，Cui等(2015)利用TALEN将人乳铁蛋白(humanlactoferrin,hLF)替换了羊的β乳球蛋白，提高了羊奶的营养价值。皮文辉等(2015)通过构建TALENs电转染至绵羊成纤维细胞中，经检测完成了FGF5基因在绵羊成纤维细胞中的起始密码子ATG定点敲除，为进一步验证绵羊FGF5基因与羊毛毛长的关系打下基础。
随后，阿力玛(2016)和李佳鑫(2016)等分别利用CRISPR/Cas9技术敲除绒山羊FGF5基因，为培育出高产绒的FGF5基因编辑绒山羊奠定基础。李聪和曹广文(2015)成功应用CRISPR/Cas9系统对绵羊MSTN基因进行敲除，证明该系统可以对于绵羊基因编辑，研究产生的突变细胞系为制备MSTN基因敲除羊提供了材料。刘健(2015)利用CRISPR/Cas9技术对绒山羊的胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞中MSTN基因成功进行敲除。
2016年，影响绵羊毛色ASIP基因编辑产生不同毛色的绵羊在新疆诞生。Fat-1基因表达为ω-3脂肪酸脱氢酶，可使脂肪酸由ω-6形式转变为ω-3，从而有益于调整动物机体内部脂类代谢。张驹等(2016)通过CRISPR/Cas9编辑技术成功敲除了山羊的MSTN基因，并且在该位点中插入Fat-1基因的载体，用电转染法将目的基因转至绒山羊胎儿成纤维细胞中，依靠体细胞核移植法来制备转Fat-1基因绒山羊，希望选育出既增加羊肉产量又同时提升羊肉中ω-3含量的山羊新品种。
3、猪
在猪到人异种移植中会引起超急性移植排斥反应。Hauschild等(2011)利用ZFN获得了α-1,3-半乳糖基因敲除猪，为器官移植手术中产生的超急性免疫排斥反应的应对提供了思路。Yang等(2011)研究中将ZFN技术与体细胞核移植技术组合，制备出过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ基因定点突变的敲除猪，有利于研究PPARγ基因在人脑血管疾病中的作用。Hauschild等(2011)又进一步使用锌指核酸酶技术完成了猪的GGTA1基因的双等位基因突变，并且发现通过该技术可只经一代的体外核移植得到敲除该双等位基因的纯合基因型。Carlson等(2012)在猪的细胞中实现了TALEN技术介导的多种基因敲除，表明了TALEN技术在猪上应用趋于成熟。
Li等(2014)在猪的基因组中发现了一个ROSA26基因位点，并用TALEN介导的基因编辑技术可进行定点重组酶介导的基因敲入，有助于解决转基因猪表型不一的问题。阮进学(2015)研究根据基因组编辑技术针对猪H11位点创建了一个高效的定点整合系统，使更为高效安全的制备转基因猪成为可能。Hai等(2014)对猪的vWF基因构建CRISPR/Cas9系统和显微注射技术组合一步就成功进行编辑，vWF基因突变的表型出血十分严重，为治疗血管性血友病提供了相似的模型，证明了CRISPR/Cas9技术在大动物模型构建中的高效性。Marron等(2013)研究发现通过ZFN技术敲除猪的MSTN基因，破坏肌肉生长抑制素的合成，可明显提高猪的瘦肉率。
我国也有许多研究表明应用编辑MSTN基因可培育出含有“双肌”性状的优良猪种群。郭仕妹(2016)首次利用CRISPR/Cas9技术和ssODN成功模拟MSTN基因自然突变，为获得肌肉表型更明显的克隆猪奠定了基础。另外，由于这种基因编辑猪的突变类型是在动物中自然存在的，并已经用于畜牧业生产。因此，通过我们这种模拟自然突变建立的高生产性能猪更容易被人们接受。康难难等(2016)利用显微注射法将sgRNA和Cas9mRNA注入猪孤雌胚胎，敲除了B2M和CIITA基因，使之主要组织相容性复合体I类与II类分子失去生物活性，进而可抑制T细胞在免疫反应中的强度，成功的实现利用猪单个胚胎进行高效快速的CRISPR/Cas9打靶位点检测。王敏等(2017)研究发现，RGS双荧光替代性报告载体的使用可以有效提高CRISPR/Cas9在猪胚胎成纤维细胞中对BMP15基因的打靶效率，为今后通过体细胞核移植技术培育BMP15基因编辑猪，提高母猪繁育能力提供依据。
二、存在的问题及发展前景
基因编辑技术发展至今已达到一定的高度，在建立动物疾病模型、培育新动物品种和治疗遗传疾病等方面有着巨大潜力。但在降低脱靶率、提高特异性以及效率等方面还有不足，CRISPR/Cas9技术虽然比其他技术更为经济快捷效率高，但在应用于不同对象上时，还应注意使用不同的方法，怎样完善基因编辑技术降低其脱靶率、提高特异性、增强其普适性成为当前应解决的问题，是否有更为有效的基因编辑技术还有待进一步研究。
三大基因编辑技术在家畜育种中起到了重要的作用，通过基因的敲除(knockout)或敲入(knockin)改变家畜的生产性状，使之向对人类有益的方向发展。基因组编辑技术被认定成一种理想的基因改造工具，因其效率高、对基因的修饰精确度高而被用于大量的研究。随着以基因编辑技术为基础的选择友好位点、连接多基因、表观调控等应用的完善，今后动物育种将有可能向规模化、多基因改良的方向发展。经过基因编辑的畜禽可促进畜牧业经济的发展，为提高人们营养水平和生活质量服务。由此可知，基因编辑技术已成为现代生物研究的重要手段之一，为了更好地为科学研究提供良好的平台，完善发展基因编辑技术成为了重中之重。
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