动物转基因技术的国际竞争动态与趋势

　　通过20多年的研究发展，动物转基因技术发展趋势呈现以下的特点。

　　一、转基因动物研究方法的发展趋势

　　1999年以前，转基因动物的生产方法主要是受精卵原核期注射（Pronuclear injection，PI），它结合了基因克隆、超数排卵、人工授精、显微注射和胚胎移植技术。PI方法产生的转基因牛、羊等大家畜的比例只有0.5%～3%。据Eyestone统计，PI后移植的4 285枚奶牛胚胎，最终获得4头转基因奶牛，成功率0.09%。再加上整合基因因位置效应的沉默，而且产生的嵌合体转基因动物有的没有发生生殖系整合，获得一头生殖系整合乳腺高表达的转基因动物研发费用巨大。1997年体细胞克隆绵羊多莉诞生后，科学家随后研制转基因克隆牛（1998）和转基因克隆山羊（1999），转基因克隆动物技术以转基因阳性细胞为供体，理论上后代100%为转基因动物，结合卵母细胞体外成熟培养技术，大大减少了受体动物饲养量，降低了研发成本。近年来还出现了高效率的转基因动物技术有慢病毒载体系统（LV），应用LV介导外源基因可以整合到小鼠的生殖系，出生老鼠80%~100%都表达外源基因。LV病毒介导转基因猪效率高达70%，外源基因的表达率高达94%。LV介导的转eGFP基因牛研究中，胚胎GFP基因表达率为92%±8%，胚胎移植后转基因动物阳性率达到83%。2005年许田的研究小组首次应用转座系统Piggy Bac研究获得转基因小鼠，阳性率40%以上。2008年美国科学家Scott等获得了转座子转基因猪，转基因效率同样大大提高。2009年广西大学石德顺课题组发现PB转座子可以显著提高水牛体细胞的转基因效率。胚胎干细胞、生殖干细胞和诱导多能干细胞（iPSCs）技术的快速发展，同样为干细胞介导转基因动物生物反应器的研发奠定了良好的工作基础。而标记基因GFP等荧光蛋白家族的广泛应用（2008年EGFP发现，获得诺贝尔奖），及其与PI、精子载体法、转基因克隆及基因打靶技术的结合，同样可以通过荧光显微镜对转基因胚胎进行直接鉴定，大大提高转基因动物的生产效率。

　　未来的重点研究方向：一是当前主流技术转基因克隆动物技术优化，通过应用新的筛选标记基因减少细胞毒害，通过导入新基因提高重组效率，通过结合流式细胞仪找到新的筛选路径，通过胚胎体外培养系统的优化提高转基因胚胎的质量。二是新的荧光标记基因开发及其与PI、精子载体法等转基因动物技术的结合，通过优化红色荧光蛋白等探索自然光下能够发出荧光的新基因，减少紫外照射对转基因胚胎的伤害；通过结合荧光标记基因鉴定胚胎并移植，提高转基因动物生物反应器的效率。三是高效率转基因动物生物反应器新技术的探索，积极探索干细胞介导、慢病毒载体系统和转座子转基因技术在动物生物反应器中的应用，研究开发高效率、低成本的转基因动物生物反应器的平台。

　　二、转基因动物功能基因的发展趋势

　　随着基因组测序技术和基因扫描技术的快速发展，越来越多的动物功能基因被挖掘，转基因动物制作的核心思想在于目的基因和调控元件的选择，未来的发展趋势主要为：

　　一是通过QTL选择重要的功能基因。畜禽的重要经济性状，大部分为多基因控制，下一步的转基因家畜新品种培育中，首先应该选择与产奶、生长、抗病及繁殖性状有强相关的基因座，通过导入显著影响生产性状的基因，提高畜禽肉、蛋、奶的产量和质量。

　　二是通过研究基因网络发现更多的候选基因。生物的单个基因无法实现自己的功能，往往是通过基因与基因的相互作用，形成复杂的基因网络，最终实现基因的功能，在网络的节点上往往又存在一些微调的开关。比如MSTN肌肉生长负调控基因的敲除会引起小鼠的肌肉快速增长且肌纤维变粗，同样转入MSTN的调控基因依然能够实现调控肌肉生长的目的。通过对基因网络的深入研究，候选相关节点的基因，则有望避免因个别基因的增加或者失活引起对动物生长发育和机体产生的负面影响。

　　三是通过对重要功能基因的时空特异性、丰度的调控，改良转基因动物的生产性状。许多动物基因存在着可变剪切，时空表达，在不同的发育阶段和不同的组织类型表达的丰度不同，行使的功能亦不相同。未来的一个重要发展趋势是通过基因组测序仪器对组织特异性表达的基因进行深入挖掘，结合QRT-PCR技术，获得一批组织特异性表达的基因，并按表达丰度分为高丰度表达、中丰度表达和低丰度表达。通过应用这些基因的启动子结合发现的重要功能基因，真正实现对基因的精确调控，减少转基因对动物的负面作用。最终实现人类按照社会需求和意愿，对畜禽生产性状进行分子设计，使转基因动物造福于全人类。

　　三、转基因生物研究模式团队作战的趋势越来越明显

　　以动、植物生物反应器技术为例，它涉及了现代农业高新技术（转基因动、植物）、现代工业技术（药用蛋白的大规模纯化）、现代医药业技术（药用蛋白质的候选、设计、动物试验、临床试验）和现代商业（证券融资和药物推广）多个领域，是一个多学科交叉融合的技术。因动、植物生物反应器药用蛋白研发周期长、费用高，单凭一个课题组或者团队、一个企业很难完成，GTCB上市的ATryn药物经历了近20年的研发，从研发到上市亏损了3亿多美元。2006年6月rhATⅢ获得EMEA批准上市后，9月法国最大的生物制药公司LFB Biotechnologies找到GTCB签订合作协议拟注资2 000万美元，共同合作开发用山羊乳腺来生产其拳头产品重组人血浆蛋白和单克隆抗体；11月丹麦LEO Pharma公司马上找到GTCB合作，愿意承担Atryn在欧洲、中东和加拿大的独家代理，而付出的代理费为7 300万美元；GTCB还购买了Mayo Clinic公司的CD137抗肿瘤单克隆抗体的专利，拟用山羊乳腺来生产CD137的单克隆抗体。当前和今后一段时间内多行业、多课题组和多领域的合作，对动、植物生物反应器制药的研发尤为重要。目前国内的企业很难能够拿出大量的资金进行长期投入，而国际实际发展需求和国内居民医疗卫生保障需求的现实，需要我国政府对高风险、长周期的动、植物乳腺生物反应器战略技术进行重点的扶持，从农业高新技术和生物制药两个领域投入，培育出高附加值的能够用于商业开发的药用蛋白生物反应器，从而吸引国内外企业进行技术和成果转化，使政府的投入成为引擎，促进动、植物生物反应器制药业的腾飞，推动我国生物制药业的发展。

　　转基因动物将会改变我们未来的世界，转基因动物生物反应器可以生产出更加适合人类临床使用的蛋白质药物，转基因的畜禽新品种将会自然抵抗人畜共患病，减少流行病的传播和对人类生存的威胁，降低肉食品的药物残留，全面提高全人类的生活质量。