中华人民共和国农业农村部公告第409号

   附件2（略）

   附件3（略）

   附件4

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书和内包装标签

一、非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书

兽用

【兽药名称】                                                     

通用名  非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

商品名  无

英文名  Real-time PCR Diagnostic Kit for African Swine Fever

汉语拼音  Feizhou Zhuwen Bingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

【主要成分与含量】

【作用与用途】  用于猪脾脏、淋巴结、肉品、血液及血液制品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

【用法与判定】

1  用法

1.1  样品处理  以下样品处理后置60℃灭活30分钟。

1.1.1  组织样品  取100～200mg待检组织样品（脾脏、淋巴结、肉品），用研钵充分研磨后，加入PBS（pH值7.2）1ml，混匀；或者加入1ml PBS（pH值7.2）和磁珠后用组织匀浆仪匀浆处理。然后以10000r/min离心3分钟，吸取上清200μl，置于1.5ml离心管中，编号备用。

1.1.2  血液  采集抗凝血，吸取200μl，置1.5ml离心管中，编号备用。

1.1.3  血液制品  取100～200mg待检血液制品（如血浆蛋白粉），置于1.5ml离心管中，加入PBS（pH值7.2）1ml，充分混匀震荡后，以10000r/min离心3分钟，吸取上清200μl，置于1.5ml离心管中，编号备用。

1.2  样品存放  采集或处理好的样品在2～8℃保存应不超过24小时；若需长期保存，须放置-70℃以下冰箱，并应避免反复冻融。

1.3  DNA提取  用商品化试剂盒按其说明书，对处理好的样品提取DNA。

1.4  荧光PCR反应体系的配制  取出试剂盒中的各组分，置室温（15～25℃）融化后瞬时离心，备用。每次检验设阴、阳性对照。设待检样品、阳性对照和阴性对照的样品总份数为n，按如下反应体系配制：

将以上配制的反应体系充分混匀后，分装至反应管中，每管17μl。分别取DNA样品3μl加入相应反应管中，盖紧管盖后瞬时离心。

1.5  荧光PCR反应条件  

第一阶段：95℃ 20秒；

第二阶段：95℃ 1秒、60℃ 20秒，共40个扩增循环。

对于ABI荧光PCR仪，选择FAM通道读取检测结果，淬灭基团选择“MGB”；

对于其他品牌的荧光PCR仪，选定FAM通道读取检测结果，淬灭基团选择“None”。

2  试验成立条件  阳性对照Ct值＜35并出现典型的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线，则判为试验成立。

3  判定  待检样品Ct值≤36并出现典型的扩增曲线，判为阳性；待检样品无Ct值并且无特异性扩增曲线，判为阴性；36＜Ct值≤40并出现典型的扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，模板量加倍（即6μl DNA）进行复检（无菌无核酸酶水减至1.5μl，其它体系不变），Ct值≤40并出现典型的扩增曲线判为阳性，无Ct值并且无特异性扩增曲线则判为阴性。

【注意事项】  （1）试剂盒应在-20℃以下保存和运输。

（2）本试剂盒仅用于体外检测使用，操作人员必须经过培训，试剂盒使用前请仔细阅读说明书全文。

（3）不要使用过期组分或者不同批次组分混合使用。

（4）使用时尽量避免反复冻融，如冻融，应不超过3次。

（5）样品采集和处理过程应戴一次性手套，并及时更换，样品间严禁交叉污染。

（6）荧光PCR实验严格分区操作，各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循单方向工作原则，各工作区相对隔离。

（7）进行荧光PCR实验的工作桌面及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1mol/L盐酸依次灭菌和消毒，或定期用紫外灯灭菌和消毒。

（8）测试样品时，应做好生物安全防护。

（9）试验完毕后，使用过的试剂盒、样品和试剂应进行无害化处理。

【规格】  （1）10份/盒  （2）20份/盒  （3）50份/盒

【贮藏与有效期】  -20℃以下保存，有效期为12个月。

【批准文号】

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

二、非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒内包装标签

          兽用

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】 −20℃以下保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

兽用

荧光PCR反应液                         

110µl（220µl、550µl）/管                             批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  −20℃以下保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

兽用

引物探针混合物                          

35µl（70µl、150µl）/管                                批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  −20℃以下保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

  兽用

无菌无核酸酶水                     

100µl（200µl、500µl）/管                            批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  −20℃以下保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

兽用

阳性对照                         

20µl（30µl、40µl）/管                                批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  −20℃以下保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用

兽用

阴性对照                         

20µl（30µl、40µl）/管                                 批准文号：

批    号：

有效期至：

【用法与判定】  详见说明书。

【贮藏与有效期】  −20℃以下保存，有效期为12个月。

【生产企业】

仅供兽医诊断使用