农业农村部关于印发《2019年动物源细菌耐药性监测计划》的通知

各省、自治区、直辖市农业农村（农牧、畜牧兽医）厅（局、委），新疆生产建设兵团畜牧兽医局，中国兽医药品监察所，各监测任务承担单位：

为贯彻落实《遏制细菌耐药国家行动计划（2016-2020年）》《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017-2020年）》，进一步加强动物源细菌耐药性监测工作，促进养殖环节科学合理用药，保障动物源性食品安全和公共卫生安全，我部制定了《2019年动物源细菌耐药性监测计划》，现印发给你们，请遵照执行。

农业农村部

2019年3月26日

2019年动物源细菌耐药性监测计划

根据《兽药管理条例》规定，为做好2019年动物源细菌耐药性监测工作，充分发挥监测工作的支撑作用，促进养殖环节科学合理用药，制定本计划。

一、 监测范围

北京、天津、河北、山西、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、上海、江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、河南、湖北、湖南、广东、广西、海南、重庆、四川、贵州、云南、陕西、甘肃、青海、宁夏、新疆等30个省（区、市）和新疆生产建设兵团。

二、 监测对象

实行定点监测与随机监测相结合的原则。从2019年开始将“全国兽用抗菌药使用减量化行动试点养殖场”（养殖场名录见附件1）作为长期定点监测场；除对长期定点监测场进行跟踪监测外，每个监测省份还须随机监测至少3个地市，每个地市随机监测至少3家养殖场或屠宰场。

三、职责任务

（一）农业农村部畜牧兽医局

负责组织开展全国动物源细菌耐药性监测工作，制定发布监测计划，分析和应用监测结果。

（二）中国兽医药品监察所（以下简称“中监所”）

负责全国动物源细菌耐药性监测的技术指导、数据库建设与维护工作，药敏试验板的设计与质量控制、监测结果的汇总分析。

（三）省级畜牧兽医行政管理部门

负责协助完成国家监测计划相关任务，协助监测任务承担单位做好采样工作。有条件的省份应积极争取财政支持，制定并组织实施本辖区动物源细菌耐药性监测计划。

（四）监测任务承担单位

农业农村部部属有关单位，可承接政府购买服务的高等院校、科研院所、省级兽药检验机构和第三方检测机构等，共同承担动物源细菌耐药性监测任务，负责实施耐药性监测工作。监测省份和监测数量见附件2。

（五）菌株保藏与鉴定单位

中监所负责对各地耐药性监测实验室分离的大肠杆菌和人畜共患病原菌（沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌）菌种的保存，并指导各任务承担单位进行沙门氏菌血清分型，承担沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定。

有关高等院校负责肠球菌、大肠杆菌、副猪嗜血杆菌、魏氏梭菌、伪结核棒状杆菌罕见耐药表型菌株的确认、收集和保存以及耐药机制的鉴定。

四、监测内容

（一）监测大肠杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌等3种细菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、庆大霉素、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异噁唑、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、头孢噻呋、头孢他啶、恩诺沙星、氧氟沙星、美罗培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹等16种抗菌药的耐药性。

（二）监测肠球菌、金黄色葡萄球菌、魏氏梭菌和伪结核棒状杆菌等4种细菌对青霉素、阿莫西林/克拉维酸、红霉素、克林霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻呋、头孢西丁、磺胺异噁唑、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、万古霉素、多西环素、氟苯尼考、苯唑西林、庆大霉素、泰妙菌素、替米考星、利柰唑胺等18种抗菌药的耐药性。

（三）监测弯曲杆菌对阿奇霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、萘啶酸、泰利霉素、克林霉素等9种抗菌药的耐药性。

（四）监测肠球菌和魏氏梭菌对四环素、吉他霉素、黄霉素、恩拉霉素、喹烯酮、那西肽、阿维拉霉素、维吉尼亚霉素、杆菌肽等9种抗菌药的耐药性。

五、监测要求

（一）各监测任务承担单位要按照《2019年度动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点》（见附件2）开展采样、细菌分离和鉴定、耐药性检测和结果上报等工作。

（二）样品应从养殖场（包括养鸡场、养鸭场、养猪场、养羊场、奶牛场）或屠宰场抽取。其中，规模化养殖场和小型养殖场应各占50%。

（三）采样时应做好养殖场用药情况和饲料来源调查，认真填写《采样记录表》（见附件3）。对同一养殖场用药情况不同的动物群，应分别填写采样表。

（四）细菌的分离和鉴定按照《动物源细菌分离和鉴定方法》（见附件4）执行。

（五）各任务承担单位进行药敏试验时应使用经过质量认证的检测板。2019年继续监测肠球菌和魏氏梭菌对促生长用抗菌药物的耐药性。药敏试验检测试剂盒（MIC测定）使用方法见附件5。

六、结果报送

（一）各监测任务承担单位登录中国兽药信息网，在中国兽药数据库下选择“兽药耐药性监测数据库系统”，输入本单位用户名和密码，上传耐药性监测数据，经实验室相关负责人审核通过后进入数据分析库，并进行总结分析。

（二）按照任务分工，各监测任务承担单位的电子版总结在11月25日前报中监所。12月31日前，中监所完成汇总报我部畜牧兽医局。

联 系 人：农业农村部畜牧兽医局  冯梁

中国兽医药品监察所    宋立

联系电话：010-59191430  010-62103679

附件：1.2019年度动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点

2.2019年动物源细菌耐药性监测数量

3.采样记录表

4.动物源细菌分离和鉴定方法

5.药敏试验检测试剂盒（MIC测定）使用方法

6.敏感性检测结果统计表

附件1

2019年度动物源细菌耐药性监测采样和检测技术要点

    一、采样安排

（一）采样地点

各监测任务承担单位按照本监测计划进行选场、采样和分离细菌，同时，负责对本省内设立的全国定点检测场（见下表），长期跟踪监测大肠杆菌和肠球菌耐药性变化趋势，

全国定点跟踪监测养殖场名录

（首批全国兽用抗菌药使用减量化行动试点养殖场名单）

（二）采样类型

病死动物采集临床病料分离动物病原菌；健康动物采集泄殖腔或盲肠拭子分离大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌和弯曲杆菌；采集新鲜牛奶分离金黄色葡萄球菌。根据养殖场规模，每个场采样30～50份。

（三）监测细菌种类

包括大肠杆菌、肠球菌（分为屎肠球菌和粪肠球菌）、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌（分为空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌）、魏氏梭菌、伪结核棒状杆菌、副猪嗜血杆菌等。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可根据各地分离情况进行监测。

二、 调查和记录

各监测任务承担单位要认真做好饲料和药物饲料添加剂来源与种类调查、采样前动物使用抗菌药物情况调查（预防用药和治疗用药）和采集样品的统计，据实填写采样记录表。

三、 细菌分离与鉴定

采用选择性培养基，定向做大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和弯曲杆菌分离，用生化试验、PCR技术或血清学方法对分离物进行鉴定。本年度分离监测的细菌种类与数量要求见附件1。分离到的菌株在-20℃以下加甘油保护剂冷冻保存或用其他合适方法自行保存，沙门氏菌和弯曲杆菌送中国兽医药品监察所进行血清型鉴定后保存。

四、 药物敏感性测定

用经中国兽医药品监察所质量认定的药敏试验板进行药物敏感性检测。检测用质控菌株由中国兽医药品监察所统一供应。

五、 结果报送

各单位需在11月25日前完成动物源细菌耐药性监测年度总结，并将电子版总结报送中国兽医药品监察所。中国兽医药品监察所汇总后，在12月31日前报送农业农村部畜牧兽医局。

附件2

2019年动物源细菌耐药性监测数量

    注：总体采样要求：根据采样地区和不同动物尽量确保菌株数量均衡。采样时，大型、中小型养殖场各半；主要采出栏前动物、鲜牛奶；分离大肠杆菌和肠球菌，每个养殖场采样30～50份，分离其他细菌，根据分离率确定样品数量。屠宰厂采样时，应采集动物的盲肠样品。分离金黄色葡萄球菌要求采集新鲜牛奶。采样必须覆盖农业农村部示范点。

附件3

采样记录表

    采 样 地：                      养 殖 场：                           

采样时间：                     联系人姓名、电话：                     

    注：a为喂奶猪或保温鸡，b为保育猪或生长鸡，c为育成猪或鸡，d为种母猪或产蛋鸡。

附件4

动物源细菌分离和鉴定方法

一、动物源大肠杆菌的分离与鉴定方法

1  范围

本方法规定了用于动物源大肠杆菌分离与鉴定的方法。

本方法适用于各种动物中大肠杆菌的分离与鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

2.1  冰箱：2℃～4℃和-20℃。

2.2  恒温培养箱：36℃±1℃。

2.3  电子天平：感量0.1g。

2.4  显微镜：10×～100×。

2.5  生物安全柜。

2.6  生化鉴定卡或商品化试纸条。

2.7  采样管或商品化采样棉拭子。

2.8  微量加样器：1μL～1000μL。

2.9  吸头（与微量加样器匹配）。

3  培养基和试剂

3.1 运送培养基。

3.2 麦康凯琼脂。

3.3 大肠杆菌阳性血清。

4  大肠杆菌分离与鉴定程序

大肠杆菌分离与鉴定程序见图1。

                     

    5  操作步骤

5.1 采样  

选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。

5.2 大肠杆菌的分离

5.2.1  拭子接种于麦康凯琼脂平板，36±1℃培养18～24h；

5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落，麦康凯琼脂纯化一代，

5.2.3 纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，36±1℃培养16～18h，待进一步细菌鉴定。

5.3 大肠杆菌的鉴定

对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定。

必要时，采用大肠杆菌标准血清进行血清型鉴定。

二、动物源沙门氏菌的分离与鉴定方法

1  范围

本方法规定了用于动物源沙门氏菌分离与鉴定的方法。

本方法适用于各种动物中沙门氏菌的分离与鉴定。

2   设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

2.1  冰箱：2℃～4℃和-20℃。

2.2  恒温培养箱：36℃±1℃和42℃±1℃。

2.3  电子天平：感量0.1g。

2.4  显微镜：10×～100×。

2.5  生物安全柜。

2.6  恒温水浴锅：37℃～100℃。

2.7  PCR仪。

2.8  电泳仪。

2.9  电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）。

2.10 冷冻离心机。

2.11  采样管或商品化采样拭子。

2.12 小型离心管。

2.13  微量加样器：1μL～1000μL。

2.14  吸头（与微量加样器匹配）。

2.15  漩涡仪。

2.16  微波炉。

3  培养基和试剂

3.1  标准菌株：沙门氏菌CVCC 541

3.2  DNA Maker

3.3  Taq DNA 聚合酶

3.4  dNTP

3.5  琼脂糖

3.6  5×TBE缓冲液

三羟甲基氨基甲烷（Tris）            54.0g

硼酸                                27.5g

0.5M  EDTA（pH8.0）                 20ml

加纯净水至                          1000ml

3.7 50×TAE buffer

三羟甲基氨基甲烷（Tris）             242g

NA2EDTA.2H2O                         37.2g

醋酸                                 57.1ml

加纯净水至                           1000ml

3.8  invA基因引物

上游为5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′

下游为5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C -3′

3.9  运送培养基。

3.11 沙门氏菌显色琼脂。

3.12 沙门氏菌阳性血清。

3.13 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）。

3.14 四硫磺酸盐增菌液（TTB）。

3.15 核酸染料。

3.16 氯化钠。

4  沙门氏菌分离与鉴定程序

沙门氏菌分离与鉴定程序见图2。

                     

    5  操作步骤

5.1 采样

选择养殖场或屠宰场，用灭菌棉拭子采集动物肠道或泄殖腔（肛门）样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。

5.2 沙门氏菌的分离

5.2.1 将拭子置于SC增菌液，36℃±1℃培养18～24h 或TTB增菌液，42℃±1℃培养22～24h。

5.2.2 将菌液混匀，接种沙门氏菌显色培养基，36℃±1℃培养22～24h。

5.2.3 挑取沙门氏菌显色培养基上紫色可疑菌落，接种营养琼脂平板，36℃±1℃培养16～24h，待进一步细菌鉴定。

5.3 沙门氏菌的鉴定

5.3.1 生化鉴定

对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，或者通过5.3.2的方法进行分子生物学（PCR）鉴定。

必要时，用沙门氏菌标准血清进行血清型鉴定。

5.3.2 PCR法鉴定

5.3.2.1 PCR模板的制备

用接种环从营养琼脂上挑选16～24h的纯培养物，置于0.5ml灭菌生理盐水中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5ml灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为PCR模板。

5.3.2.2 PCR反应体系的配制

   根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系，扩增片段长度约284 bp。

5.3.2.3 PCR反应条件

95℃预变性5min，94℃变性30s, 64℃退火30s，72℃延伸30s, 30个循环，最后72℃延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。

5.3.2.4 电泳

5.3.2.4.1 1.2%琼脂糖凝胶板的制备

称取1.2g琼脂糖，加入100ml0.5×TBE（或1×TAE）缓冲液中，加入核酸染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加0.5×TBE（或1×TAE）缓冲液淹没胶面。

5.3.2.4.2 加样

取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入加样孔，每次电泳时，各做一个阳性对照和阴性对照。

5.3.2.4.3 电泳条件

电压110V，电泳时间30min。

5.3.2.5 结果判定

电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。

如果某一待检样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为沙门氏菌，必要时可通过测序来进一步确证。

三、动物源金黄色葡萄球菌的分离与鉴定方法

1  范围

本标准规定了用于耐药性测定的动物源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定方法。

本标准适用于牛奶、动物组织和上呼吸道中金黄色葡萄球菌的分离和鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1  冰箱：0℃～4℃和-20℃。

2.2  恒温培养箱：36℃±1℃和42℃。

2.3  显微镜：10×～100×。

2.4  商品化或自制采样管。

2.5  无菌离心管

2.6  离心机。

2.8  商品化拭条或微生物鉴定仪。

3  培养基和试剂

3.1  标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213

3.2  显色培养基

3.3  7.5%氯化钠肉汤10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤

3.4  营养肉汤或BHI肉汤

3.5  营养琼脂

3.6  新鲜兔血浆或商品用凝固酶试验兔血浆

3.7  0.3%过氧化氢液

3.8  0.85%无菌生理盐水

4  金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序

金黄色葡萄球菌分离和鉴定程序见图3。

                     

    5  操作步骤

5.1  采样

5.1.1  牛奶样品：到已选定的奶牛养殖场，现场采牛奶置入灭菌试管中，0℃～4℃保存，不超过48h。

5.1.2  扁桃体、发病动物组织和上呼吸道拭子：无菌操作取发病动物组织和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入灭菌试管中，0℃～4℃保存不超过48h。

5.1.3  吸取1ml牛奶样品或将上呼吸道拭子至盛有10ml 7.5%氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤中，振荡混匀。

5.2  增菌和分离培养

5.2.1  将上述样品匀液于36℃±1℃培养18～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

5.2.2  将上述培养物，分别划线接种到显色培养基平板上，无菌操作将发病动物组织直接划线， 36℃±1℃培养24～48h。

5.2.3  挑取可疑菌落。用营养琼脂纯化一代，待进一步细菌鉴定。

5.3  金黄色葡萄球菌的鉴定

5.3.1生化鉴定  将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。

将新鲜纯化、经触酶试验阳性待检细菌单个菌落，悬浮于5ml灭菌生理盐水，按照生化鉴定试条使用说明书操作， 37℃培养18～24h后判读结果。

5.3.2  血浆凝固酶试验法   挑取显色平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5ml BHI和营养琼脂平板，36℃±1℃培养18～24h。将在营养琼脂上培养24h以内的待鉴定细菌，首先进行触酶试验，应为阳性。

新鲜兔血浆制备：称取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水100ml,溶解后过滤，装瓶，121℃高压灭菌15min。取3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置（或以3000r/min 离心30 min），使血液细胞下降，即可得血浆。

取新鲜配置兔血浆0.5 ml，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2～0.3 ml，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。

四、动物源弯曲杆菌的分离与鉴定方法

1  范围

本标准规定了动物源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离鉴定方法。

本标准适用于粪便拭子和盲肠内容物中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离与鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下。

2.1  采样管

2.2  采样棉拭子

2.3  生物安全柜

2.4  恒温培养箱: 25℃±1℃，36℃±1℃，42℃±1℃。

2.5  恒温水浴锅：37℃～100℃。

2.6  微需氧条件：5%氧气+10%二氧化碳+85%氮气，或商品化微需氧包。

2.7  显微镜：10×～100×。

2.8  微生物生化鉴定系统或者生化鉴定拭条

2.9  高速冷冻离心机：≥12000r/min。

2.10  小型离心管：1.5ml。

2.11  微量加样器：1μL～1000μL。

2.12  吸头（与微量加样器相匹配）

2.13  PCR仪

2.14  微波炉

2.15  电泳仪

2.16  电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）

3  培养基和试剂

3.1  质控菌株：空肠弯曲杆菌标准菌株（ATCC 33560）

3.2  DNA  Marker

3.3  引物及扩增片段长度

3.3.1  引物

空肠弯曲菌：上游 5’ CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT    3’，下游 5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GAC  3’，扩增片段长度为 773bp。

结肠弯曲杆菌：上游：AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC，下游：TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGCTAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC，扩增片段长度为364bp。

3.4  运送培养基

3.5  弯曲菌选择性（CCD）培养基

3.6  哥伦比亚血琼脂培养基

3.7  生理盐水

3.8  10 ×PCR 缓冲溶液Ⅱ

3.9  氯化镁溶液（25mM）

3.10  Taq 聚合酶（0.5U/μL）

3.11  dNTPs（2mM）

3.12  琼脂糖

3.13  50×TAE缓冲液：将242gTris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5M  EDTA（pH8.0），加纯水至1000ml。

1×TAE缓冲液： 临用时将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。

3.14  上样缓冲液

3.15  溴化乙锭溶液（10mg/ml）：称取1g溴化乙锭溶于100ml水中，用磁力搅拌器搅拌数小时直至完全溶解，避光冷藏（4℃）保存。

3.16  矿物油

4  空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序

空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的分离与鉴定程序见图4。

                     

    5  操作步骤

5.1  分离与纯化

5.1.1  分离

将新鲜或者运送培养基中的粪便拭子或盲肠内容物在CCD培养基上涂抹，用经火焰灭菌并冷却的接种环与涂抹处垂直划线。

5.1.2  培养

将上述接种后的平板置于42℃±1℃恒温培养箱中，在微需氧条件下培养24h～48h。

5.1.3  纯化

观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。挑取灰色、湿润、凸起、光滑圆润、边缘整齐的可疑单菌落，按3.2的培养条件培养纯化。

5.2  鉴定

5.2.1  生化鉴定

对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定，并进行结果判定。或者通过5.1～5.4的试验进行分子生物学（PCR）鉴定。

5.2.2  分子生物学（PCR）鉴定

用接种环从哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量的纯培养物置于盛有0.5ml生理盐水的小型离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。再加0.5ml灭菌水，悬浮并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，取出置于冰浴中冷却5min后，12000r/min（4℃）离心2min，取上清作为PCR模板。

5.2.2.1  PCR反应体系

根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系。同时设立阴性和阳性对照。

5.2.2.2  PCR反应条件

采用的PCR反应条件见下表。

PCR反应程序表

5.2.2.3  电泳

5.2.2.3.1  1.0%琼脂糖凝胶板的制备

称取1.0g琼脂糖，加入100ml0.5×TBE缓冲液（或1×TAE缓冲液）中。加热融化后加5μL（10mg/ml）溴化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加0.5×TBE缓冲液（或1×TAE缓冲液）淹没胶面。

5.2.2.3.2  加样

取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物各1孔作为对照。

5.2.2.3.3  电泳条件

电压110V，电泳时间40min。

5.2.2.4  结果判定

电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。

如果某一待检样品扩增产物的条带与空肠弯曲菌阳性对照的条带在一条直线上，即它们与加样孔的距离相同，则该样品分离到的菌株可判定为空肠弯曲杆菌；如果与结肠弯曲菌阳性对照的条带在一条直线上，即它们与加样孔的距离相同，则该样品分离到的菌株可判定为结肠弯曲杆菌；

必要时，可以通过测序来进一步确证。

五、动物源屎肠球菌和粪肠球菌的分离与鉴定方法

1   范围

本方法规定了用于屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定的方法。

本方法适用于各种动物中屎肠球菌和粪肠球菌的分离与鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

2.1  冰箱：2℃～4℃和-20℃。

2.2  恒温培养箱：36℃±1℃。

2.3  电子天平：感量0.1g。

2.4  显微镜：10×～100×。

2.5  生物安全柜。

2.6  生化鉴定卡或商品化试条。

2.7  采样管或商品化采样棉拭子。

2.8  微量加样器：1μL～1000μL。

2.9  吸头（与微量加样器匹配）。

3  培养基和试剂

3.1 运送培养基。

3.2 肠球菌显色培养基。

4  屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序

屎肠球菌和粪肠球菌分离与鉴定程序见图5。

                     

    5  操作步骤

5.1  采样 

选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物肛门或泄殖腔样品，置入运送培养基中，保存时间不超过48小时。

5.2  屎肠球菌和粪肠球菌的分离

5.2.1  拭子接种于肠球菌显色琼脂平板，36℃±1℃培养18～24h；

5.2.2  挑取红色至紫红色的可疑菌落，显色琼脂上纯化一代，

5.2.3  纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，36℃±1℃培养16～18h，待进一步细菌鉴定。

5.3  屎肠球菌和粪肠球菌的鉴定

对于已纯化的菌落，可使用微生物生化鉴定系统或者生化拭条进行生化鉴定、判定结果。

必要时，采用肠球菌标准血清进行血清型鉴定。

六、动物源魏氏梭菌分离与鉴定方法

1  范围

本方法规定了畜禽源魏氏梭菌（Clostridium perfringens）的分离与鉴定。

本方法适用于畜禽源魏氏梭菌的分离与鉴定。

2  设备和材料

需要的主要设备和材料如下：

2.1  商品化采样管或采样棉签；

2.2  普通冰箱：2 ℃～4℃和-20℃；

2.3  超低温冰箱：-80℃；

2.4  恒温培养箱：37℃；

2.5  恒温水浴锅：37℃～100℃；

2.6  生物安全柜；

2.7  天平：感量0.1 g； 

2.8  显微镜：10×～100×；

2.9  微量加样器及吸头：1μL-1000μL；

2.10  接种环或接种针；

2.11  离心管：2ml，5ml；

2.12  试管：18mm×180mm；

2.13  培养皿：直径60 mm，直径90 mm； 

2.14  厌氧气罐：用于厌氧工作站，气体成分：88%N2，7%H2，5%CO2；

2.15  密封培养罐；

2.16  厌氧产气袋：用于密封罐，可吸收罐中的全部O2，同时产生约21%的CO2；

2.17  厌氧工作站；

2.18  PCR仪；

2.19  微波炉；

2.20  电泳仪；

2.21  电泳凝胶成像分析系统。

3  培养基和试剂

3.1  运送培养基

3.2  液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）

3.3  胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂

3.4  脑心浸液（BHI）琼脂

3.5  绵羊血琼脂平板

3.6  P-15B D-环丝氨酸

3.7  灭菌液体石蜡

3.8  无菌生理盐水

3.9  缓冲动力-硝酸盐培养基

3.10  硝酸盐还原试剂

3.11  乳糖-明胶培养基

3.12  含铁牛乳培养基

3.14  革兰氏染色液

3.15  硝酸盐还原试剂

试剂甲：对氨基苯磺酸溶液，试剂乙：α-萘酚乙酸溶液。

3.16  商品化细菌DNA提取试剂盒

3.17  质控菌株：粪肠球菌 ATCC29212，金黄色葡萄球菌 ATCC29213

3.18  DNA Marker（2000bp）

3.19  Taq DNA 聚合酶

3.20  dNTPs

3.21  琼脂糖

3.22  50×TAE缓冲液

242g三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5M EDTA（pH8.0），加纯水至1000ml

3.23  1×TAE缓冲液

临时用是将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。

3.24  核酸染料

3.25  16S rDNA通用引物（预期扩增子大小为1500bp）

上游为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA

下游为1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT

4  魏氏梭菌的分离与鉴定程序

                    

    5  操作步骤

5.1  采样

5.1.1  肛拭子或泄殖腔拭子：做好采样准备后赴养殖场或屠宰厂，针对拟采样的健康畜/禽或发病畜/禽个体，用无菌棉签插入其肛门或泄殖腔采集粪便，采集的健康畜/禽与发病畜/禽的样品比例为1:1，置于运送培养基。

5.1.2  粪便样品：做好采样准备后赴养殖场或屠宰厂，针对拟采样的健康畜/禽或发病畜/禽，用无菌棉签蘸取其排泄的新鲜粪便（用灭菌镊子扒开粪便表皮，蘸取内部粪便），置于运送培养基。

5.1.3  肠道内容物：做好采样准备后赴养殖场或屠宰厂，针对拟采样的屠宰或剖检畜/禽，无菌剪取其正常/异常肠段（盲肠或结肠段），结扎后置于无菌自封袋。

5.1.4  将上述采集的样品，做好标注后立即置于带有冰袋的保温设备中，转运至试验室（转运时间不超过48h）。

5.2  增菌和分离纯化

5.2.1  增菌培养

（1）棉拭子和粪便样品：从盛有样品的运送培养基中吸取液体200μL，放入含2ml FTG的5ml离心管中，加入灭菌液体石蜡封住液面，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h进行增菌；

（2）肠道内容物：无菌剪开肠段，用接种环刮取内容物， 放入含2ml FTG的5ml离心管中混匀，用石蜡封住液面，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h进行增菌。

5.2.2  分离纯化

吸取增菌液1ml放入90mm无菌平皿内，每个平皿倾注冷却至50 ℃的TSC 15 ml，混匀。琼脂凝固后，再加10 ml 冷却至50 ℃的TSC均匀覆盖于表层。待琼脂再次凝固后，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h。挑取黑色且有乳白色晕圈的单菌落接种于绵羊血琼脂平板上，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，挑取有溶血环的菌落。用相同绵羊血琼脂平板纯化2-3次。

5.3  魏氏梭菌鉴定

5.3.1  菌株培养

从绵羊血琼脂平板上任选5 个（小于5 个全选）有溶血环的菌落，分别接种到FTG 培养基，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h。

5.3.2  形态观察

挑取菌落进行革兰氏染色，镜检观察细菌形态。魏氏梭菌为革兰氏阳性粗短杆菌，呈紫色，有时可见芽孢体。如果形态多样，表明培养液不纯，应划线接种绵羊血琼脂平板，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，挑取单个典型有溶血环的菌落接种到FTG 培养基，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，做进一步纯化。已纯化的菌株可用于后续的生化鉴定或PCR鉴定试验。

5.3.3  牛乳汹涌发酵试验

取生长旺盛的FTG 培养液1 ml 接种于含铁牛乳培养基，在46 ℃±0.5 ℃水浴中培养2 h 后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。魏氏梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。

5.3.4  生化鉴定

（1）硝酸盐还原—动力试验 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h。在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。然后滴加0.5 ml 试剂甲和0.2 ml 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min 内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10 min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。魏氏梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

（2）乳糖发酵-明胶液化试验 用接种环（针）取FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，观察结果。如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。将试管于5 ℃左右放置1 h，检查明胶液化情况。如果培养基是固态，再放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，重复检查明胶是否液化。魏氏梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。

5.3.5  分子生物学（PCR）鉴定

（1）PCR模板制备  从FTG培养基中取0.5-1ml纯培养物，于灭菌的1.5ml离心管中，按细菌DNA提取试剂盒操作指南提取菌株基因组DNA，作为PCR模板。

（2）PCR反应体系配制  总体积为50μL，其中PCR Taq DNA聚合酶25μL，16S rDNA通用引物上、下游各1μL，模板1μL，dd H2O 22μL，设立阴性与阳性对照。

（3）PCR反应条件  94℃预变性 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min30s，共30个循环；72℃ 7min。扩增产物长度约为1500bp。

（4）电泳  反应结束后，将PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为：电压120V，电泳时间25min。电泳结束后，用凝胶成像仪进行成像分析。

（5）结果判定  将电泳后显示条带的PCR产物送去测序公司进行16S rRNA测序，将返回的测序结果用NCBI上的Blast进行比对分析。

5.4  菌种保存

将鉴定完毕并确认是魏氏梭菌的菌株接种于绵羊血琼脂平板上，放入厌氧工作站或密封培养罐中，37 ℃厌氧培养20-24 h，将板子上的菌落全部刮下，置于含有500μL FTG的1.5ml离心管，和500μL甘油（60%）充分混匀，放入-80℃超低温冰箱保存。

七、副猪嗜血杆菌的分离与鉴定方法

1 范围

本方法规定了动物源副猪嗜血杆菌的分离与鉴定方法。

本方法适用于副猪嗜血杆菌的分离与鉴定。

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。

2.1  冰箱：2-4℃和-20℃。

2.2  恒温培养箱：37±1℃。

2.3  电子天平：感量0.1g。

2.4  分析天平：感量0.1mg

2.5  恒温水浴锅：37℃～100℃

2.6  生物安全柜

2.7  显微镜：10×～100×

2.8  PCR仪

2.9  电泳仪

2.10  电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）

2.11  微量加样器：1μL～1000μL

2.12  吸头（与微量加样器匹配）

2.13 细菌多位点接种仪

2.14  96孔板

3  培养基和试剂

标准菌株：副猪嗜血杆菌SH0165

质控菌株：胸膜肺炎放线杆菌ATCC 27090

3.1  无支原体胎牛血清。

3.2  胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）

3.3  胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）

3.4  Amies运送培养基

3.5  辅酶NAD

3.6  DNA Maker 2000

3.7  Taqmix DNA 聚合酶

3.8  琼脂糖

3.9  50×TAE buffer

               三羟甲基氨基甲烷（Tris）        242g

NA2EDTA.2H2O                    37.2g

醋酸                            57.1ml

加纯净水至                      1000ml

3.10  16sRNA引物

上游引物   5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’

下游引物   5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’

4  副猪嗜血杆菌分离与鉴定程序

                     

    5  操作步骤

5.1  采样 

选择养殖场或屠宰场，灭菌棉拭子采集动物鼻腔拭子，或屠宰猪的完整肺脏、心包液、胸腔积液、关节液和脑脊液，置入冰盒中，保存时间不超过48小时。鼻腔拭子置于加有1%NAD的Amies运送培养基中。

5.2  副猪嗜血杆菌的分离

5.2.1  肺脏：用酒精灯火焰对肺脏表面进行消毒，用消毒的剪刀和镊子剪取一小块病灶，用内切面在加有5%胎牛血清和10μg/ml NAD的TAS平板边缘1/4涂板，再用无菌的接种环采取三线式划法，对细菌进行划线分离培养，37℃培养36-48h；取鼻腔拭子于加有5%胎牛血清和10μg/ml NAD的TAS平板上三段划线，37℃培养36-48h。

5.2.2  挑取半透明、边缘光滑的可疑菌落于2.5ml加有5%胎牛血清和10μg/ml NAD的无菌TSB肉汤，37℃培养18-24h。

5.2.3  纯化后可疑菌落接种营养琼脂平板纯化，37℃培养36h，待进一步细菌鉴定。

5.3   副猪嗜血杆菌的鉴定

5.3.1  镜检

挑取纯培养的圆形、光滑、无色透明可疑菌落涂片，革兰染色后，显微镜下观察细菌形态。副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性短杆菌，菌体大小不一。

5.3.2 卫星实验

用接种环分别挑取上述可疑菌的单菌落，水平划线于绵羊鲜血琼脂平板上， 再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃ 培养24ｈ～48ｈ，观察是否有“卫星生长”现象。

5.3.3  副猪嗜血杆菌的PCR鉴定

在纯化培养后的TSA 培养基上挑取单菌落，接入加有1% NAD 与5%胎牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中，37℃，220 r/min 摇床振荡培养18h左右。取培养后的菌液1μL做PCR鉴定，阳性对照为副猪嗜血杆菌参考株SH0165。阴性对照不加模板。根据副猪嗜血杆菌16S rRNA（M75065）序列设计引物。由金斯瑞生物技术有限公司合成，见表5-1。采取20 μL反应体系，组成成分见表5-2。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性10 s，59℃退火10 s，72℃延伸1 min，30 个循环；最后72℃延伸10 min。

表1  副猪嗜血杆菌PCR鉴定引物序列

表2  PCR体系各组分一览表

5.3.4  1%琼脂糖凝胶电泳

称取1g琼脂糖，加入100ml 1×TAE 缓冲液中，加入核酸染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖溶化后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拔出梳子，取出胶块放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。

取10µLPCR扩增产物和3µL上样缓冲液混匀后加入加样孔，每次电泳时，各做一个阳性对照和阴性对照。电泳条件：电压110V，电泳时间30min。

结果判定：电泳结束后，取出胶块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。如果某一待检样品扩增产物的条带与副猪嗜血杆菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相同，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可初步判定为副猪嗜血杆菌。

5.4  副猪嗜血杆菌的保存

在纯化后的平板上挑取单菌落与8ml肉汤中，置于37℃摇床中培养18～24h，待菌液生长至对数期，于9000r/min，离心3分钟，弃去上清液，加入4ml灭菌的脱脂牛奶，重悬。再分装值灭菌的冻干管，每管1ml。再将分装的菌进行逐级冷冻，先后置于4℃，-20℃，-80℃至少4h以上。最后将菌液置于冻干机冻干1～2天，冻干后置于-80℃冰箱长期保存。

八、动物源伪结核棒状杆菌的分离与鉴定方法

1  范围

本标准规定了动物源伪结核棒状杆菌的分离鉴定方法。

本标准适用于脓汁中伪结核棒状杆菌的分离鉴定

2  设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1 生物安全柜

2.2 冰箱：0 ℃ ～ 4 ℃ 和 -20 ℃

2.3 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃

2.4 显微镜：10 ×～ 100 ×

2.5 EP管:1.5 ml

2.6 采样管

2.7 采样棉拭子

2.9 微量加样器

2.10 吸头 （与微量加样器相匹配）

2.11 PCR仪

2.12 微波炉

2.13 电泳仪

2.14 电泳凝胶成像分析系统（或紫外透射仪）

3  培养基和试剂

3.1 DNA Marker

3.2 引物及扩增片段长度

PLD基因引物：

上游：CTCAAGGCGTGGATGA

下游：GGTAGCCAGATGGTGAGTAG

3.3 运送培养基

3.4 10 ％的绵羊脱纤血平板

3.5 2×Taq PCR MasterMix （含染料）

3.6 琼脂糖

3.7 50×TAE缓冲液：将242 g Tris 碱，57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA（pH 8.0），加纯水至1000 ml。

1×TAE缓冲液：临用时将50×TAE缓冲液1份加蒸馏水49份，混匀即可。

3.8 溴化乙锭溶液（10㎎/ml）：称取1 g溴化乙锭溶于100 ml水中，用磁力搅拌器搅拌数小时至完全溶解，避光冷藏（4 ℃）保存。

4  伪结核棒状杆菌分离与鉴定程序

                     

    5  操作步骤

5.1 采样

无菌采取脓汁样品置于运送培养基中，0 ℃～4 ℃保存。

5.2分离与纯化

5.2.1 分离

将新鲜的或运送培养基中的脓汁拭子在10％绵羊脱纤血琼脂平板上涂抹，用经火焰灭菌后冷却的接种环划线。

5.2.2 培养

将上述接种后的平板置于37 ℃ 恒温培养箱中培养24h～48h。

5.2.3 纯化

观察24h和48h的血琼脂平板上的菌落形态，挑取圆形、不透明、干燥、松脆、瓷白色或淡黄色、不溶血或仅有狭窄α溶血的小菌落按5.2.2培养条件培养纯化。（革兰氏染色呈阳性小球杆菌）

5.3 鉴定

5.3.1 生化鉴定

对于已纯化的菌落，可使用细菌微量生化反应管进行生化鉴定，并对照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行结果判定。

5.3.2 PCR鉴定

5.3.2.1 PCR模板的制备

用接种环从血平板上挑取适量的纯培养物置于盛有0.5 ml生理盐水的小型离心管中，12000r/min离心两分钟，弃上清。再加0.2ml灭菌水涡旋混匀，100℃水浴10min，12000r/min离心两分钟，取上清作为PCR模板。

5.3.2.2 PCR反应体系

根据不同厂家PCR试剂用量，配置PCR反应体系。扩增目的片段长度约758 bp.

5.3.2.3 PCR反应条件

94 ℃预变性2min，94 ℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环，最后72℃终延伸10min，同时设立阴性和阳性对照。

5.3.2.4 电泳

称取1.0g琼脂糖，加入100ml 1×TAE缓冲液。加热熔化后倒入水平台面的凝胶盘中，胶板厚约5 mm。依据样品数选择适宜的梳子。凝胶凝固后，放入电泳槽，于加样孔中加样，以 DL2000为对照，120v，30min 后，在溴化乙锭溶液中浸泡20min。之后于紫外凝胶成像系统或紫外投射仪中观察结果。

5.3.2.5 结果判定

如果某一待检样品扩增产物的条带与伪结核棒状杆菌阳性对照的条带在一条直线上，即他们与加样孔的距离相同，则该样品可判定为伪结核棒状杆菌。必要时可通过16S rRNA测序进行进一步验证。

附件5 

药敏试验检测试剂盒（MIC测定）使用方法

1  范围

本方法规定了动物源细菌（大肠杆菌、沙门氏菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌、魏氏梭菌和伪结核棒状杆菌）药敏检测试剂盒的操作方法。

2  材料

除微生物实验室常规灭菌设备外，其他设备和材料如下：

2.1 恒温培养箱35±2℃

2.2 生物安全柜

2.3 浊度计或者标准比浊管

2.3 微量加样器1uL～1000uL

2.4 吸头（与微量加样器匹配）

3  操作步骤

3.1 取出试剂盒，打开包装待用。

3.2 菌液制备

将无菌棉签用生理盐水润湿后，直接取过夜培养皿上数个新鲜菌落，与适量无菌生理盐水混匀。然后，用标准比浊管或者浊度计校正菌液浓度至0.5麦氏单位（1～2×108CFU/ml）。最后，用试剂盒中的肉汤按照使用说明书要求的倍数稀释，混匀备用。

3.3 菌液接种

除空白对照外，其余的95孔加入制备好（用前要混匀）的菌液100µL

空白对照孔中加入100µL无菌肉汤。盖好板盖并记录菌号。

3.4 孵育

将检测板置于35℃±2℃很稳培养箱中孵育16～18小时。

3.5 观察结果

在衬有黑底板的光线下，用肉眼观察。

先观察阴性对照孔和阳性对照孔：阴性对照孔应无细菌生长，孔内液体未见浑浊；阳性对照孔内应有细菌生长所形成的圆形或者网状沉淀。

如果阴性和阳性对照结果正常，继续观察其余孔内细菌生长情况，在无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。

4  结果记录

将MIC结果记录在耐药性检测结果统计表（附件6）中。

附件6

敏感性检测结果统计表

    一、G-菌（大肠杆菌、沙门氏菌和副猪嗜血杆菌）MIC

    殖场：                              检测员：               年   月   日

    注：直接填写检测的MIC数值。

    二、G+菌（肠球菌、金黄色葡萄球菌和伪结核棒状杆菌）MIC

     养殖场：                              检测员：             年   月   日

    注：直接填写检测的MIC数值。

    三、弯曲杆菌MIC

养殖场：                           检测员：                年   月   日 

注：直接填写检测的MIC数值。

    四、肠球菌和魏氏梭菌MIC（促生长抗菌药物监测）

养殖场：                        检测员：                   年   月   日 

    注：直接填写检测的MIC数值。